关键词： 组织相容性抗原-Ⅰ类；子宫内膜异位症

【摘要】目的探讨子宫内膜异位症患者在位子宫内膜表面主要组织相容性复合物-Ⅰ类(major histocompatibility complex-classⅠ, MHC-Ⅰ)抗原的表达及其调控。方法分离9例子宫内膜异位症患者在位子宫内膜间质细胞，采用流式细胞仪(flowcytometry, FCM)检测其表面MHC-Ⅰ抗原水平；经体外培养和γ-干扰素调节间质细胞表面MHC-Ⅰ抗原水平，并测定不同MHC-Ⅰ抗原水平的内膜间质细胞对淋巴因子激活杀伤(lymphokine-activated killer， LAK)细胞活性。结果间质细胞表面MHC-Ⅰ抗原的基础表达有变异，但幅度不大，FCM荧光强度主要分布于10¹～10²之间；体外培养2周后，间质细胞MHC-Ⅰ抗原水平明显降低，FCM荧光强度分布明显左移，主要分布于10⁰～10¹之间，对LAK细胞毒作用敏感(LAK活性为51.28%)；而体外培养后再经γ-干扰素处理过的间质细胞MHC-Ⅰ抗原恢复至新分离水平，对LAK细胞毒作用产生抵抗(LAK活性为28.64%)。 结论子宫内膜间质细胞上MHC-Ⅰ抗原对自然杀伤(NK)和NK样T细胞毒性具有抑制作用，而间质细胞表面MHC-Ⅰ抗原的水平是可调节的。

Expression of Major Histocompatibility Complex-class I Antigen on Endometrial Stroma Cells in Patients with Endometriosis

XIN Yunbi, XU Xiaorong, LING Huhua.

（Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Chongqing University of Medical Sciences, 400016 Chongqing, China）

【Abstract】ObjectiveTo study the possible effect of major histocompatibility complex-class Ⅰ (MHC-Ⅰ) antigen on endometrial stromal cells in endometriosis patients. MethodsThe stromal cells of endometrium was separated and cultured in vitro. γ-interferon (γ-IFN) was added to modulate the MHC-Ⅰ antigen level which was assessed by flowcytometry, and the sensitivity of endometrial stromal cells to cytotoxic lymphocytes was examined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT). ResultsOur study demonstrated that in vitro cultured stromal cells with significant reduced MHC-Ⅰ antigen levels showed enhanced susceptibility to lysis (51.28%) mediated by lymphokine-activated killer (LAK) cells, whereas γ-IFN treated in vitro cultured stromal cells with restored MHC-Ⅰ antigen levels showed more resistance to lysis (28.64%). ConclusionsMHC-Ⅰ antigen on endometrial stromal cells may inhibit the cytotoxicity of natural killer (NK) cells and NK-like T cells, which might play a key role in the pathogenesis of endometriosis. The level of MHC-Ⅰ antigen could be regulated by culture or some biologic factors such as γ-IFN.

【Key words】Histocompatibility antigens class Ⅰ;Endometriosis

子宫内膜异位症(endometriosis, EM)病因未明。研究表明，自然杀伤细胞(NK细胞)为主的杀伤性淋巴细胞的细胞毒功能异常在该病的发病中起关键作用^［1］，主要组织相容性复合物-Ⅰ类(MHC-Ⅰ)抗原对NK及NK样T细胞具有抑制作用^［2］。我们检测在子宫内膜中占大多数的间质细胞表面的MHC-Ⅰ抗原水平及其调控，为进一步阐明其在EM发病中的可能意义提供依据。

资料与方法

一、实验对象

为1997年6月至1998年3月就诊我科、经腹腔镜检查证实，按修订的美国生育协会标准诊断为Ⅰ～Ⅱ的期EM患者9例，于月经周期的中、晚分泌期刮取其在位子宫内膜，并经病理检查证实。

二、方法

1.子宫内膜间质细胞的分离、纯化与培养^［3］：每份标本分双份进行培养，于培养2周时，向其中之1份加入γ-干扰素500 μg/ml，继续培养48 h收获。

2.淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞制备：无菌状态下抽取患者静脉血3 ml，枸橼酸抗凝后利用密度梯度离心法，分离得到单个核细胞(包括单核、巨噬细胞和淋巴细胞)。用含20%胎牛血清1 000 U/ml重组白细胞介素、2 500 μg/ml γ-干扰素的培养基RPMI 1640全营养液(后两者可激活LAK细胞)，调整细胞浓度至5×10⁵/ml，置36.5℃、5%二氧化碳饱和湿度孵箱培养，每48 h换液，至2周收获。

3.内膜间质细胞表面MHC-Ⅰ抗原检查：采用流式细胞仪，以0.1%胰酶消化新分离的和培养处理后的子宫内膜间质细胞，调整浓度至5×10⁵/ml，取100 μl细胞悬液加入抗人类白细胞抗原A、B、C的单克隆抗体10 μl，再加入荧光素异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体10 μl混匀，以1%多聚甲醛100 μl固定后，置4℃保存或直接用流式细胞仪(FCM)检测，FCM荧光强度反映MHC-Ⅰ抗原表达强度。

4.LAK细胞活性测定：采用4-甲基偶氮唑蓝(MTT)法。以培养后的子宫内膜间质细胞调整至2×10⁵/ml作为靶细胞，效应细胞为由静脉血内分离出的LAK细胞，浓度调整至1×10⁷/ml，按效应细胞与靶细胞之比为5∶1加样作为实验孔，同时设空白对照、靶细胞对照及效应细胞对照孔，于5%二氧化碳、37℃条件下恒温孵育18 h，再加入反应底物MTT(5 g/L)，继续孵育4 h后，加入显色剂显色，并读取相应波长的吸光度(A)值。LAK细胞活性由以下公式推算：

LAK细胞活性(%)=(1-实验孔A)/(效应细胞孔A+靶细胞孔A)×100%

5.统计学处理：实验结果用±s表示，两样本间比较采用t检验。

结果

一、子宫内膜间质细胞表面MHC-Ⅰ抗原的表达与调节

间质细胞表面MHC-Ⅰ抗原的基础表达有变异，但幅度不大，FCM荧光强度主要分布于10¹～10²间(图1，2)。体外培养2周，间质细胞表面MHC-Ⅰ抗原水平明显降低，FCM荧光强度分布明显左移，主要分布于10⁰～10¹间(图3，4)。体外培养的细胞经γ-干扰素处理48 h后，其已降低的MHC-Ⅰ抗原水平恢复至接近基础表达水平(图5，6)。

A：阴性对照B：子宫内膜间质细胞(下同)

1分泌中期子宫内膜间质细胞MHC-Ⅰ抗原基础表达

图2分泌晚期子宫内膜间质细胞MHC-Ⅰ抗原基础表达

图3体外培养2周后分泌中期间质细胞表面MHC-Ⅰ抗原水平

二、子宫内膜间质细胞表面MHC-Ⅰ抗原对LAK活性的影响

当体外培养2周MHC-Ⅰ抗原明显降低后，LAK细胞对间质细胞的杀伤活性较高，达51.28%。体外培养后的间质细胞经γ-干扰素处理48 h后，恢复其MHC-Ⅰ抗原水平，LAK细胞对其杀伤率降至28.64%。两者间LAK活性差异有极显著性(P＜0.001)。

讨论

一、子宫内膜间质细胞表面MHC-Ⅰ抗原的调节

Semino等^［4］的研究发现，EM患者在位子宫内膜上皮细胞经体外培养2周后，表面MHC-Ⅰ抗原明显降低而CD⁺₅₈CD⁺₅₄抗原保持不变，表明体外培养可致细胞表面蛋白质选择性丢失。这种选择性丢失，可能是由于所用培养基缺乏某种该蛋白的基因表达所必须的蛋白质所致^［5］。α、γ-干扰素对这种因受某些因素抑制而呈低水平表达的细胞表面MHC-Ⅰ抗原有升调节作用^［4，6］。本研究发现，体外培养2周后子宫内膜间质细胞表面MHC-Ⅰ抗原亦明显降低，γ-干扰素处理后，可回复至接近基础表达水平，但γ-干扰素作用48 h后，抗原表达达到一个平台不再继续升高，提示这种诱导能力并非无限。二、MHC-Ⅰ抗原水平对LAK活性的影响

图4体外培养2周后分泌晚期间质细胞表面MHC-Ⅰ抗原水平

图5体外培养2周后分泌中期间质细胞经γ-干扰素作用48 h后MHC-Ⅰ抗原水平

图6体外培养2周后分泌晚期间质细胞经γ-干扰素作用48 h后MHC-Ⅰ抗原水平

本研究中观察到，子宫内膜间质细胞在体外培养2周后，细胞表面MHC-Ⅰ抗原水平明显降低，LAK细胞［为NK细胞和杀伤性T淋巴细胞(cytotoxic T cell, CTL)的混合细胞群］对其杀伤活性达51.28%，当用γ-干扰素处理48 h，恢复MHC-Ⅰ抗原水平后，LAK对其杀伤活力相应降至28.64%。再次证实MHC-Ⅰ抗原抑制NK及NK样T细胞毒性作用^［4］。

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