关键词： 原位杂交，荧光；染色体异常；产前诊断；羊水

【摘要】目的探讨荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization , FISH）技术在快速产前诊断胎儿染色体数目异常中的价值。方法对20例孕16～36周、有产前诊断指征者，在B超引导下经腹抽取羊水后，应用X、Y、18号染色体着丝粒探针13q14-q21和21q11特异性探针，对未培养的羊水间期细胞进行FISH，然后用荧光显微镜进行观察，并用Applied Imaging 染色体成像系统进行摄像和后期处理。结果20例产前诊断者中，羊水间期细胞染色体数目正常者19例（XX 10例，XY 9例），染色体数目异常者1例（46，XY/ 47，XXY ），此例经引产后取脐血，经G带染色体检查证实。讨论FISH用于羊膜腔穿刺后24 h内诊断胎儿染色体数目异常，快速、准确。

Application of the Fluorescent in Situ Hybridization on the Prenatal Diagnosis of the Fetal Aneuploidy in the Uncultured Amniocytes

QI Qingwei，SUN Nianhu, HAO Na, et al.

（Department of Obstetrics and Gynecology，Chinese Academy of Medical Science, Peking Union Medical College, Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100730， China）

【Abstract】ObjectiveTo study the method and value of fluorescent in situ hybridization (FISH) on the rapid prenatal diagnosis of the fetal aneuploidy in the uncultured amniocytes. Methods Amniocentesis was performed in 20 pregnant women of 16～36 gestational weeks with indications of prenatal diagnosis. We performed FISH, respectively, with the biotin labelled chromosome X and 18 centromeric probes and the digoxin labelled chromosome Y centromeric and 21q11 and 13q14-q21 specific probes on the uncultured amniocytes. The slides were observed under the fluorescent microscope and the images were captured by the Applied Imaging System. ResultsNormal chromosome number was observed in 19 cases: 10 cases of 46, XX and 9 cases of 46, XY. Aneuploidy was found in 1 case which was 46, XY/ 47, XXY and proved by G-banding chromosomal on cord blood. ConclusionFetal aneuploidy could be diagnosed within 24 hours after the amniocentesis by FISH. FISH is a rapid, accurate and reliable method to detect fetal aneuphoidy in uncultured amniocytes.

【Key words】In situ hybridization, fluorescence; Chromosome abnormalities; Prenatal diagnosis; Amniotic fluid

传统的羊水细胞遗传学诊断具有许多无法克服的局限性，如取材时间有限，培养耗时长（10～14 d），技术稳定性差，尤其是对染色体的嵌合现象很难作出解释，这是因为中期分裂相的数目较少，不能提供足够的分析信息。荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization, FISH)技术,将分子生物学和细胞遗传学技术相结合，可以很好地克服上述局限性，将其应用于未培养的羊水间期细胞，并可于孕16周以后的任何时间，分析大量的细胞以获得足够的信息，同时可于羊膜腔穿刺后24 h内快速明确有无胎儿染色体数目异常。我们采用X、Y、18号染色体着丝粒探针和13q14-q21和21q11特异性探针，成功地将FISH应用于未培养的羊水间期细胞进行产前诊断，现报道如下。

资料与方法

一、 资料来源

选择1998年4月～1999年12月在我院遗传咨询门诊需进行产前诊断者20例，年龄25～41岁，孕周16～36周，产前诊断指征包括孕妇年龄大于35岁16例，B超发现胎儿异常2例，常规羊水染色体检查发现染色体核型异常2例。

二、实验方法

1．羊水采集：在B超引导下，用9号穿刺针经腹抽取羊水10 ml，置于无菌试管中待检。

2．羊水间期细胞制备：将10 ml羊水离心后弃上清液，加入5 ml 张氏培养液后混匀，其中4 ml用于常规羊水染色体制备，另1 ml离心后弃上清液，加入1％枸橼酸钠于37℃低渗23 min，离心后弃上清液，加入新鲜配置的甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液，于-20℃固定20 min。

3.羊水间期细胞的FISH分析：将固定后的细胞悬液离心后弃上清液，常规涂片,将其顺序置于磷酸缓冲液和70％、90％、100％乙醇中各2 min后，再置60℃烤片1 h。用含100 μg/L RNA酶的37℃ 2倍氯化钠枸橼酸钠溶液孵育1 h，再于含100 μg/L胃蛋白酶的37℃ 0.01 mol盐酸中孵育15 min。70％去离子甲酰胺80℃变性3 min后，于-20℃预冷的70％、90％、100％乙醇中顺序脱水。将已变性的探针滴于玻片上，加盖玻片，置37℃温箱过夜，然后顺序用2倍氯化钠枸橼酸钠溶液、 0.1倍氯化钠枸橼酸钠溶液清洗2次，将抗地高辛-异硫氰酸荧光素和抗生物素-艾莱克萨594 各1 μl滴于玻片上，加盖玻片后，置于37 ℃温箱孵育45 min。用磷酸缓冲液清洗5 min，用4，6-二氨基-2-苯基吲哚进行染色后，于BX60荧光显微镜下观察，每例计数100～200个细胞，用Applied Imaging染色体成像系统摄像，并进行后期处理。

4.探针选择：每例分别用生物素标记的pBAM（X染色体着丝粒探针）^［1］和L1.84（18号染色体着丝粒探针）^［2］，地高辛标记的PDP97（Y染色体着丝粒探针）^［3］、CFK26 （13q14-q21特异性探针）、CB21C1（21q11特异性探针）^［4］进行杂交。

结果

一、 羊水间期细胞染色体检测结果

20例产前诊断者羊水染色体检测中，胎儿染色体数目正常者19例（XX 10例，XY 9例），染色体数目异常者1例（46，XY/47，XXY）。20例中有1例孕妇年龄41岁，丈夫60岁，于孕20周行常规羊水染色体分析，发现大多数分裂相的核型为46，XY，但有1个分裂相的核型为47，XXY，对其间期羊水细胞进行FISH分析，镜下计数200个细胞，发现90％的细胞有2个杂交信号（1个X染色体信号和1个Y染色体信号），约10％的细胞有3个杂交信号（2个X染色体信号和1个Y染色体信号），证实其为46，XY/ 47，XXY的嵌合体（图1）；另一例为高龄孕妇，常规羊水染色体分析发现大多数细胞核分裂相的核型为46，XX，有3个分裂相核型为45，XO，对其间期羊水细胞进行FISH分析，镜下计数200个细胞，发现98％的细胞有2个杂交信号（2个X染色体信号），说明胎儿核型为46，XX（图2）。

图1细胞核型47，XXY。细胞出现3个杂交信号，2个红色信号(X染色体)， 1个绿色信号(Y染色体)。异硫氰酸荧光素染色(绿色)、艾莱克萨594染色(红色)和4，6-二氨基-2-苯基吲哚染色(蓝色)×100

图2细胞核型46，XX。细胞出现2个杂交信号，2个红色信号(X染色体)。艾莱克萨594染色(红色)×100

二、 临床结果

对第1例病例进行引产后，取脐血进行染色体G带分析，证实其确为46，XY/ 47，XXY的嵌合体；对第2例行脐静脉穿刺染色体G带分析，证实其确为46，XX的正常核型；另18例进行羊水细胞遗传学分析和新生儿脐血染色体分析，其核型与产前诊断全部相符。临床复合率为100％。

讨论

一、 未培养的羊水间期细胞FISH分析准确性

传统的羊水细胞遗传学诊断有许多无法克服的局限性，尤其是对羊水细胞染色体嵌合现象很难解释，因其可能是真的嵌合现象，也可能是没有任何临床意义的、培养造成的假象，鉴别其真假需要对大量的细胞进行分析。而传统的羊水细胞培养很难提供足够多的细胞以供分析。我们应用FISH技术，对20例未培养的羊水间期细胞进行染色体数目异常与否的产前诊断，诊断出1例46，XY/ 47，XXY的嵌合体，并计算出异常核型的比例；另一例传统羊水细胞遗传学诊断结果为46，XX/45，XO 的嵌合体，而胎儿核型实为46，XX，羊水中期分裂相中45，XO的核型可能是由于制片质量的问题，也可能是羊水培养过程中造成的假象，没有临床意义。FISH技术在上述两例中都对临床上决定下一步处理提供了更多的依据；且经临床追踪，该方法的准确性为100％。

二、未培养的羊水间期细胞FISH分析的可行性和优越性

新生儿最常见的染色体异常为X、Y、13、18、21号染色体的数目异常，染色体结构异常仅占极少数，故应用X、Y、 18 号染色体着丝粒探针和13q14-q21和21q11特异性探针对未培养的羊水间期细胞进行FISH分析，即可发现大多数胎儿的染色体异常。未培养的羊水间期细胞的FISH分析，可于孕16周以后的任何时候取材，并可于羊膜腔穿刺后24 h内快速诊断胎儿染色体数目异常^［5］；特别是由于可分析大量的细胞，对于染色体嵌合现象，还可以计算出异常核型的比例，克服了传统羊水细胞遗传学检查的局限性，为临床提供足够的和可靠的依据；所用的探针制备简便，价格低廉，故这一方法快速、简便、可靠、经济，具有实用价值，值得在临床上推广应用。

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