从孕妇外周血中分离胎儿细胞并进行遗传性疾病的检测，具有十分重要的临床价值。为了避免大量的母血细胞对胎儿细胞检测的干扰，必须对母血中的胎儿细胞进行分离富集。本研究采用流式细胞技术对36例孕妇外周血中的有核红细胞(NRBCs)进行分离纯化，初步探讨NRBCs在母血中的含量及与孕周的关系。

一、资料与方法

1.标本来源： 选择1997年10月至1998年6月在我院行产前检查的健康妊娠妇女36例(妊娠组)，年龄21～28岁，孕周12～27周，均为第1次妊娠，无严重贫血（血红蛋白＞90 g/L）等妊娠合并症或并发症。对照组分别选择健康未孕妇女10例(未孕组)，年龄为21～25岁，我院1998年1月至6月出生的新生儿10例(脐血组)。每次采血5 ml。

2. 实验方法：（1） 标本制备：抽取肘前静脉血，按常规方法分离，获得单个核细胞层。普通光学显微镜下计数细胞总数。（2）直接免疫荧光染色：按1×10⁵/μl比例加入异硫氰酸(FITC)标记的CD71单克隆抗体（华美生物公司产品，为鼠IgM），孵育30 min后重悬于0.5 ml磷酸缓冲液中。（3）分选CD71阳性细胞：FACSort型流式细胞仪为美国Becton-Dickson公司产品。样品测试前，先用标准荧光微球校准仪器。设定分选参数，将标记好的细胞用聚合甲醛固定后上机分选。（4）观察项目：收集分选细胞离心后，制成滴片直接置于荧光镜下。找到阳性细胞后，将玻片干燥再行Wright′s染色，置于普通光学显微镜下观察其形态学特征。显微镜为日本产Olympus荧光显微镜。

3.统计学处理：采用t检验。

二、结果

1. CD71阳性细胞分布：根据视窗中前向角散射（FSC）、侧向角散射(SSC)及细胞大小，细胞颗粒性可分为3个区域：低度FSC,SSC为红细胞，中度为淋巴细胞，高度为粒细胞。NRBCs位于中度区域，荧光强度在10²～10³区域。

2. NRBCs的富集及染色情况：荧光镜下标记上CD71单克隆抗体的细胞膜表面呈现绿色荧光，此类细胞为阳性细胞。将流式细胞仪分选后的细胞滴片，置于荧光显微镜下观察发现，妊娠组的阳性细胞极少，再将其涂片行瑞氏染色，发现细胞体积较淋巴细胞大，胞浆呈淡蓝色，胞核大而浓染，胞核与胞浆比约为2∶1。符合NRBCs的形态学特征。而脐血组阳性细胞丰富，膜表面荧光强，瑞氏染色符合NRBCs特征的细胞多。未孕组则未找到符合上述特点的细胞。

3.CD71阳性细胞表达情况：妊娠组妇女外周血中CD71阳性细胞的平均含量为(0.39±0.26)×10^-2，未孕组妇女的CD71阳性细胞的平均含量为(0.07±0.04)×10^-2，而脐血组的CD71阳性细胞平均含量高达(3.88±0.75)×10^-2。妊娠组与其他两组比较，差异均有极显著性(P＜0.01)。

4.CD71阳性细胞在外周血中的比例与孕周的关系：孕12周至17周，CD71阳性细胞的含量从0.11×10^-2升至0.64×10^-2，孕19周后逐渐降为0.22×10^-2。

三、 讨论

1. 流式细胞仪分选NRBCs:有研究表明，20 ml母血中仅含0～20个胎儿细胞，用于产前诊断的唯一途径是对胎儿细胞进行富集^［1］。近年来流式细胞仪分选功能的不断完善^［2］。脐血的CD71阳性细胞含量最为丰富，这与脐血富含NRBCs有关。而非孕妇女由于血中不含NRBCs，其在荧光强度10²～10³区域内的细胞数几乎为0。妊娠妇女则介于二者之间。对阳性细胞较为集中的区域，进行分选获得的CD71阳性细胞含量较国外学者报道的10^-5的比例更高，达到了富集微量细胞的目的。Zheng等^［3］证实，流式细胞仪分选细胞的纯度和回收率均高于其他分选方法。

2．孕妇外周血中NRBCs的比例与孕周的关系: 明确胎儿细胞在孕妇外周血中出现的时间与孕龄的关系，是指导产前检查采血时机的关键。本研究发现，在孕早期外周血中NRBCs的含量随着孕周的增加而逐渐增加，孕17～19周达高峰，以后随孕周的增加逐渐下降，与马旭等^［4］的结果较为相似。

本课题受卫生部基金资助（基金编号：96-2-112）

参考文献

1，Simpson Jl. Isolating fetal nucleated red blood cells from maternal blood: the baylor experience-1995. Prenat Diagn, 1995, 15:907-912.

2，左道富,主编. 流式细胞术与生物医学. 沈阳： 辽宁科学技术出版社, 1996. 19-22，80-81.

3，Zheng YL, Demaria M, Zhen D, et al. Flow sorting of fetal erythroblasts using intracytoplasmic anti-fetal haemoglobin: preliminary observations on maternal samples. Prenat Diagn，1995, 15: 897-905.

4，马旭,王毅,王琳,等. 经母血采集胎儿细胞行产前诊断的最佳时间探讨. 中华妇产科杂志, 1997, 32：293-295.

(收稿日期：1999-07-22)