关键词： 子宫内膜；胶原酶类；卵植入；金属蛋白酶α组织抑制剂

【摘要】目的探讨基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和组织金属蛋白酶抑制物-3(TIMP-3)蛋白在人种植窗期子宫内膜组织中表达的特点，及其在胚胎着床中的作用。方法应用链菌生物素蛋白-过氧化酶连接法，观察13例增殖期、10例分泌早期、17例种植窗期及15例分泌晚期子宫内膜组织中MMP-9和TIMP-3蛋白的表达特点及其阳性细胞的分布规律。结果MMP-9和TIMP-3蛋白在各期子宫内膜中均有表达，从增殖期到分泌早期至种植窗期，MMP-9和TIMP-3蛋白染色逐渐增强，以种植窗期增强最为明显，分泌晚期染色强度虽较种植窗期略低，但仍明显高于增殖期。结论种植窗期子宫内膜中MMP-9和TIMP-3蛋白为高表达, 可能参与胚胎着床的调节，有利于胎盘的形成。

Expression of Matrix Metalloproteinase-9 and Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-3 Protein in the Implantation Window Phase of Endometrium

LI Li，CHEN Shiling，XING Fuqi.

（Department of Obstetrics and Gynecology，Nanfang Hospital，First Military Medical University，Guangzhou 510515， China）

【Abstract】ObjectiveTo study the expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and tissue inhibitor of metalloproteinase-3 (TIMP-3) protein in the implantation window phase of endometrium and the role of MMP-9 and TIMP-3 on embryo implantation. MethodImmunohistochemical analysis was employed to demonstrate the population of the MMP-9 and TIMP-3 positive cell in endometrium of different phases of menstrual cycle. ResultsThe positive cells of these soluble proteinases were found to be located in the endometrial epithelial cells and stromal cells. The quantitative analysis of MMP-9 and TIMP-3 proteins demonstrated an increase in staining exent from proliferative endometrium to the endometrium of implatation window phase, and an decrease to late-secretory endometrium in comparison with the implantation window phase. ConclusionExpression of MMP-9 and TIMP-3 in the implantation window phases of endometrium is specific and may play an important role in regulating the depth of trophoblast invasion during embryo implantation and may be involved in endometrial stromal breakdown during menstruation.

【Key words】Endometrium； Collagenases； Ovum implantation； Tissue inhibitor of-metalloproteinase-3

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和组织金属蛋白酶抑制物(tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs)对正常月经周期子宫内膜细胞的生长、分化及月经来潮的发生，起重要的调节作用^［1-5］。关于人正常月经周期的第19～21天(即implantation window, 种植窗期)子宫内膜MMPs和TIMPs蛋白表达，及其在胚胎着床中的作用机理的研究，文献报道较少。本研究以其他时期子宫内膜为对照，着重研究了种植窗期子宫内膜中MMP-9和TIMP-3蛋白表达的特点，以探讨MMP-9和TIMP-3在胚胎着床中的作用。

材料与方法

一、子宫内膜组织标本来源

正常月经周期子宫内膜标本55例，取自第一军医大学附属南方医院妇产科因输卵管不通而行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗的患者，年龄22～35岁，既往月经周期28天，近期内(3月内)未使用过甾体类药物。其中增殖期组13例，分泌早期组10例，种植窗期组17例，分泌晚期组15例，均经病理学检查，符合Noyes等^［2］报道的内膜评分标准。将各组子宫内膜取出，去除表面血迹，经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，5 μm厚切片。

二、方法

1.石蜡切片标本免疫组化采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法：(1)石蜡切片脱蜡，0.3%H₂O₂封闭内源性过氧化物酶20 min；(2) 进行微波炉抗原热修复；(3) 磷酸盐缓冲液(PBS)连续洗3次，每次5 min；(4) 将切片标本置于湿盒内加10%正常兔血清，室温下放置10 min；(5)弃去多余血清，分成MMP-9和TIMP-3两组，分别滴加一抗(山羊抗人MMP-9多克隆抗体，山羊抗人TIMP-3多克隆抗体，均为美国Santa Cruz公司产品)，4℃冰箱过夜；(6) PBS连续洗3次，每次5 min；(7) 滴加二抗(生物素标记兔抗山羊IgG，美国Vector公司产品)，37℃水浴30 min；(8) PBS连续洗3次，每次5 min；(9) 滴加酶标底物(辣根酶标记链霉亲和素，美国Vector公司产品)，37℃水浴30 min；(10) PBS连续洗3次，每次5 min；(11) DAB显色，苏木素复染，逐级乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。空白对照采用PBS代替一抗，阳性对照采用子宫内膜癌组织。

2.结果观察和判定：用低倍和高倍镜观察切片，阳性细胞为镜下组织细胞结构清晰，细胞浆内有棕黄色颗粒沉着，染色明显高于背景。根据以下标准将染色细胞数量分为4级：(1) 0级：即阴性，细胞内无棕黄色颗粒出现；(2) (+)级：即弱阳性，少于10%的细胞内出现较浅的阳性染色，但明显高于阴性对照，个别细胞可中至强阳性；(3) (++)级：即中度阳性，介于弱阳性与强阳性标准之间；(4) (+++)级：即强阳性，60%以上细胞中至强阳性染色，少数细胞可为弱阳性染色。

图1MMP-9在种植窗期内膜中的表达。SP×200

图2TIMP-3在种植窗期内膜中的表达。SP×200

人巨细胞病毒感染的绒毛及蜕膜组织病理改变

结果

一、MMP-9蛋白表达的周期性变化

全部子宫内膜标本中，MMP-9蛋白呈阳性表达，腺上皮细胞、腔上皮细胞和基质细胞胞浆内均可见棕黄色物质沉着，上皮细胞染色强度大于基质。从增殖期到分泌早期至种植窗期MMP-9蛋白染色逐渐增强，尤其是种植窗期染色增强最明显(图1)；分泌晚期染色强度与种植窗期相比略有降低，但明显高于增殖期。

二、TIMP-3蛋白表达的周期性变化

TIMP-3蛋白表达定位和周期性变化与MMP-9蛋白相似。整个月经周期中，子宫内膜腺上皮细胞、腔上皮细胞和基质细胞胞浆中均可见棕黄色物质，上皮染色强度大于基质。种植窗期TIMP-3蛋白的表达(图2)明显高于增殖期和分泌早期，分泌晚期与种植窗期相比，TIMP-3蛋白表达强度近似。

讨论

细胞外其质的降解是个复杂的生理过程，对正常组织的发育及某些疾病过程中组织的重塑是必不可少的^［3］。MMPs是催化细胞外基质降解的主要酶类之一，此类酶原的活化及活化酶的抑制，在控制细胞外基质的降解过程中起重要作用。人体内抑制MMPs的主要物质有α 2-巨球蛋白和组织金属蛋白酶抑制物(TIMPs)家族。已有研究报告，MMPs/TIMPs之间的动态平衡，对于产后子宫复旧、创伤愈后以及骨骼重塑等生理性活动是非常重要的。

一、MMP-9/TIMP-3与胚泡着床

胚胎着床包括3个阶段，滋养层细胞对其游走部位子宫内膜细胞外基质的降解是关键步骤之一。Reponen等^［4］用原位杂交法对小鼠绒毛滋养层细胞及蜕膜细胞中MMPs和TIMPs的表达进行检测时发现，MMP-9及TIMP-3特异性表达于胚胎着床区，认为主要是MMP-9/TIMP-3参与调节胚胎着床过程中的细胞外基质的降解。我们在研究中观察到，在正常子宫内膜中，主要是腺上皮细胞、腔上皮细胞和基质细胞表达MMP-9/TIMP-3蛋白，其表达强度与月经周期有关。发现MMP-9与TIMP-3蛋白在人正常月经周期的种植窗期的子宫内膜中表达特异性增高，这表明MMPs/TIMPs可能与胚胎着床密切相关。种植窗期子宫内膜对胚泡容受性最强，是胚胎着床的最佳时期。子宫内膜腺上皮细胞、腔上皮细胞和基质细胞高水平表达MMP-9蛋白，促进子宫内膜细胞外基质降解，使细胞间连接疏松，有利于绒毛滋养层细胞穿透母体子宫内膜；TIMP-3蛋白伴随MMP-9也呈高表达，拮抗MMP-9对细胞外基质的降解作用，避免滋养层细胞对子宫内膜的过度侵袭，二者间形成动态平衡，有利于胚泡植入，又可避免滋养层细胞过度侵袭对组织造成损害，使妊娠得以顺利进行。任何原因导致的种植窗期子宫内膜TIMP-3蛋白表达降低或MMP-9蛋白表达过高，都可能造成细胞外基质的过分降解，滋养层细胞过度侵入子宫内膜，影响胚泡植入，甚至是导致病理性自然流产发生的重要原因之一。

二、MMP-9/TIMP-3与胎盘血管形成

Schnaper等^［5］通过一个体外新生血管的模型证实了MMPs/TIMPs在血管形成中的重要性，增加外源性MMPs的浓度可促进血管管腔形成，此效应可被TIMPs所抑制，表明血管内皮管腔的形成有赖于的MMPs/TIMPs平衡。

Zhang等^［6］进行TIMPs在人月经周期中作用的研究时发现，不仅子宫内膜基质细胞、腺上皮细胞表达TIMPs，而且