关键词： 白细胞，单核；DNA引物；聚合酶链反应；植入前诊断

【摘要】目的探讨单细胞简并寡核苷酸引物聚合酶链反应（DOP-PCR）扩增全基因组DNA 的均匀性及植入前胚胎遗传学研究的新途径。方法获取正常男女性、X单体、X、13和21三体细胞，行单细胞DOP-PCR，通过比较基因组杂交（CGH ）双色荧光强度比变化，分析扩增均匀性。结果 (1) DOP-PCR产物/正常男性基因组DNA CGH： 约1/3常染色质区强度比均数及标准差超过正常允许范围，X染色体假性过度表达，13、21三体无明显变化。(2) DOP-PCR产物/正常男性单细胞DOP-PCR产物CGH： 94%强度比均数及标准差接近期望值，能显示正常男女性、X单体、X、13和21三体染色体拷贝数变化。结论单细胞DOP-PCR扩增基因组DNA存在明显的不均匀性，但这种不均匀扩增是非随机的。如选择合适的参照，扩增产物可用于植入前胚胎等单细胞全基因组研究。

Study on the Amplification Uniformity of Whole Genome in a Single Cell by Degenerate Oligonucleotide Primed Polymerase Chain Reaction

JIN Fan, HUANG Hefeng, YE Yinghui, et al.

（Department of Obstetrics, Affiliated Obstetrics and Gynecology Hospital, Faculty of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310006, China）

【Abstract】ObjectiveTo investigate the uniformity of whole genome amplification from a single cell by degenerate oligonucleotide primed polymer ase chain reaction (DOP-PCR）. MethodsAmplification of the whole genomic DNA from a single cell with XX, XY, XO, XXY, +13 or +21 was performed by DOP-PCR. Comparative genomic hybridization (CGH) of a single cell DOP-PCR product against the genomic DNA or a single cell DOP-PCR product from normal male as carried out respectively. ResultsThe average profile of fluorescence intensive ratio in CGH with the genomic DNA as the reference was greatly fluctuated and the standard deviation in about 30% haploid was beyond the normal limits. False positive hyperrepresentation was existed in X chromosome while trisomy 13 and 21 were failed to be detected. However, the distributions of the mean and the standard deviation of the ratio in the CGH with DOP-PCR product as the reference were acceptable. The copy number changes of chromosome X,Y, 13 and 21 were demonstrated. ConclusionAlthough the single cell DOP-PCR product is not completely uniform, it would be reliable to study the whole genome of a single cell by controlling the conditions of PCR and selecting the suitable control reference because the unequal amplification is unrandom.

【Key words】Leukocytes, monomuelear; DNA primers; Polymerase chain reaction; Preimplantation diagnosis

简并寡核苷酸引物聚合酶链反应（degenerate oligonucleotide primed polymerase chain reaction , DOP-PCR）是一种全基因组DNA扩增技术，因其扩增DNA具有均匀性，故该技术已开始应用于微量组织的全基因组DNA分析^［1-3］。但迄今为止，稀释至单细胞水平的组织 DNA DOP-PCR 的结果并不理想。本研究试图探索建立单细胞DOP-PCR技术，并应用比较基因组杂交（comparative genomic hybridization, CGH ）^［4,5］ 考察单细胞DOP-PCR扩增全基因组DNA 的效率和均匀性，旨在探索植入前胚胎全基因组研究的新途径^{［6 ］}。

资料与方法

一、资料来源

从我院遗传门诊获取正常男性、正常女性及特纳（XO）、克氏（XXY ）、唐氏（XY,+21）综合征患者外周血淋巴细胞，从产前诊断病例获取帕氏（XY,+13）综合征胎儿羊水培养的成纤维细胞。

二、方法

1. 单细胞DOP-PCR：参照Cui等^［7］的方法，获取上述个体的单个淋巴细胞和成纤维细胞，分别移至0.5 ml PCR反应管中。氢氧化钾、二硫苏糖醇（KOH/DTT，美国Sigma公司产品）法裂解细胞。向各含单细胞裂解产物PCR反应管，加入100 mmol 三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl， 美国Sigma公司产品）pH 8.3、 20 mmol氯化镁 (MgCl₂, 美国Sigma公司产品)、2 mmol脱氧核苷三磷酸（dNTP, 美国Perkin-Elmer/Cutes公司产品)、0.01% 明胶（gelatin， 美国Sigma公司产品）以及20 μmol DOP-PCR引物 (5′-CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G-3′) (德国Boeheinger Mannheim公司产品)各5 μl，5 IU AmpliTaq DNA多聚酶 (美国Perkin-Elmer / Cetus公司产品)， 反应总体积50 μl。

扩增程序为（1）94℃，10 min，（2）94℃，1 min；30℃，1.5 min；30℃升至72℃，3 min；72℃，3 min；5个周期。（3）94℃，1 min；62℃，1min；72℃，3 min ＋14 s /每周期；共35个周期。1％琼脂糖凝胶电泳检测DOP-PCR产物，纯化后用分光光度仪测定DNA浓度。

2. CGH分析及结果判定： 通过缺口翻译^［8］ 将光谱绿脱氧尿苷三磷酸(SpectrumGreen-dUTP，绿色荧光，美国Vysis公司产品) 或TRITC-脱氧尿苷三磷酸（TRITC-dUTP， 红色荧光，德国Boeheinger Mann- heim公司产品)分别标记于上述各单细胞的DOP-PCR产物。400ng SpectrumGreen-dUTP标记DOP-PCR产物（SG-DOP-PCR) 与等量光谱红正常男性基因组DNA (XY-SR，美国Vysis公司产品)或TRITC-dUTP标记正常男性单个淋巴细胞DOP-PCR产物 (XY-TRITC-DOP-PCR) 及10 mg人Cot-1DNA混匀后，参照Kallioniemi等^［9］的方法，制备杂交液、杂交靶（正常男性淋巴细胞中期分裂相），并进行杂交、杂交后洗涤和CGH标本制备。使用荧光显微系统获取CGH图像，用美国Vysis 公司QUIPS CGH分析软件分析CGH结果，绿/红双色荧光强度比均数正常值下限为0.85，上限为1.15。每例CGH分析5个中期分裂相，去除着丝粒、端粒、近端着丝粒染色体短臂等异染色质区，观察各CGH双色荧光强度比均数、标准差和95％可信限范围，在染色体组上分布的变化。

结果

一、DOP-PCR产物

各类细胞分别进行5个单细胞DOP-PCR。DOP-PCR产物长度为150～23 000 bp，纯化后DNA量约为2.0μg, 阴性空白对照可见引物相关产物( primer related product)^［2］， 但长度＜1 000 bp。 经调整DNA多聚酶I与DNA酶I的比例和缺口翻译作用时间, 缺口翻译产物SG-DOP-PCR或TRITC-DOP-PCR长度控制在100～1 500 bp。

二、CGH结果

1．SG-DOP-PCR/ XY-SR CGH: (1)沿染色体长轴分布的CGH绿/红荧光强度比均数波动幅度较大，30.9%正常常染色质区的强度比标准差超出0.85～1.15的正常CGH允许范围^［9］。 (2)随X染色体拷贝数的增多, X染色体强度比逐渐上升, 但即便XO或XY, X染色体也呈过度表达(强度比＞1.15)。 (3) 13三体时有13号染色体过度表达倾向， 但强度比均数未超出正常范围上限, 未见21三体时21号染色体的过度表达。

2．SG-DOP-PCR/ XY- TRITC-DOP-PCR CGH： (1） 正常常染色质区CGH强度比均数接近期望值（1.0）， 均数波动幅度小, 仅6.0%强度比标准差超出允许范围。（2） XO或XY的X染色体未见过度表达, 而XX或XXY的X染色体强度比＞1.15，XX和XO的Y染色体呈低表达状态（＜0.85）。（3）13、21三体时的13和21号染色体大部分常染色质区强度比过度表达(＞1.15)。

讨论

一、DOP-PCR的效率和均匀性

植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diag- nosis)的难点之一，是可检测材料极为有限，通常仅1～2个活检胚胎细胞，约15～30 pg的基因组DNA。因此，全基因组DNA扩增技术对开展植入前胚胎遗传学诊断意义重大。目前，较常用的全基因组扩增方法有扩增前引物延伸法（primer extension preamplification，PEP）和DOP-PCR等。其中DOP-PCR 在起始的数个周期，应用的是低温引物连接。当引物3′端的6个特异核苷酸与模板DNA互补连接后，引物中央的6个随机核苷酸及5′端的10个特异核苷酸，可随机与模板DNA连接。短小的特异结合序列，使引物能同时与众多模板DNA位点结合，同时启动这些位点的复制功能。再经多周期的高温特异PCR，达到按比例均匀扩增整个基因组DNA的目的^［3］。DOP-PCR是开展植入前胚胎基因组DNA重复和缺失研究的重要候选途径^［6］。

本研究直接以单细胞裂解产物为模板，进行二步法DOP-PCR。共经40个周期扩增后，纯化扩增产物DNA达2.0 μg。CGH分析显示，沿染色体组纵轴分布的双色荧光强度比均数波动明显，其中近1/3的强度比标准差超出允许波动范围。X染色体强度比均数明显高于预期值，而13三体的强度比变化不显著，21三体未见强度比的增高。可见，单细胞DOP-PCR扩增产物与基因组DNA间存在偏离，该扩增存在不均匀性。其原因除Telenuis等^［2］观察到的低起始模板量，引起DOP-PCR扩增效率和均匀性下降外，还可能与裂解产物不同DNA区域引物结合位点暴露程度的差异，及实验显示的引物相关产物的生成有关。

二、DOP-PCR不