关键词： 受体，表皮生长因子-尿抑胃素；植入前期；胚胎；免疫荧光法

【摘要】目的研究表皮生长因子（EGF）受体在植入前胚胎细胞中的表达及其生物学意义。方法应用间接免疫荧光法检测人植入前胚胎细胞EGF受体的表达情况。结果未受精卵即卵母细胞、受精卵卵裂后2细胞期至10细胞期胚胎细胞表面均有EGF受体的表达，其表达量的荧光强度基本一致。结论EGF受体在植入前胚胎细胞中有表达，EGF超家族成员中的肝素结合EGF可能通过与EGF受体结合，参与早期人类胚胎的生长、发育和着床。

Expression of Epidermal Growth Factor Receptor in Human Preimplantation Embroys

JIANG Qunying

（Department of Obstetrics and Gynecology, Wulumuqi General Hospital, Lanzhou Military Area, Wulumuqi 830000, China）

CHEN Shiling, XING Fuqi.

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) in human preimplantation embryos and to explore the effect of EGFR on human embryos growth, development and implantation. MethodsTo detect the localization and expression of EGFR in human preimplantation embryos with indirect immunofluorescence assays(IIF). ResultsThere was EGFR expression in human preimplantation embryos from unfertilized oocyts,2-cell,4-cell,6～8 cell to 10-cell stages embryos. EGFR protein located on the cell membrance surface, and had no obvious variation in intensity of staining from whole stages embryos. ConclusionThe expression of EGFR was present in human preimplantation embryos, heparin-binding EGF-like epidermal growth factor (HB-EGF), one of the EGF superfamily members act through the EGFR, EGFR expression may have an imporant role in human embryos growth, development and implantation.

【Key words】Receptos, epidermal growth factor-urogastrone; Preimplantation phase; Embryo; Fluoroimmunoassay

表皮生长因子（EGF）超家族成员包括EGF、转化生长因子α（TGF-α）、肝素结合EGF（HB-EGF）和双调蛋白(Ar)等，所有这些细胞因子都是EGF受体(EGFR)的配基，通过与EGFR结合，并激活EGFR后发挥生物学作用^［1］。已知EGFR广泛存在于人体的许多器官和组织中，近年来有报道，在女性生殖系统如子宫平滑肌、子宫内膜、蜕膜、胎膜和胚泡滋养层细胞中有表达，可促进子宫内膜的生长和分化，在滋养细胞的形成和发育中发挥重要作用，并与分娩发动有关^［2，3］。还有研究发现，在人类和啮齿类动物植入前的胚胎也存在EGFR^［4-7］，EGF家族中的HB-EGF促进胚胎细胞表面EGFR的表达，从而影响人和啮齿类动物植入前胚胎的发育，介导胚泡的着床^{［8, 9］}。我们应用间接免疫荧光法观察了EGFR在植入前胚胎的表达及定位，探讨其与人类早期胚胎的生长、发育和着床的关系。

资料与方法

一、标本来源

选取1999年8月～2000年1月在第一军医大学南方医院妇产科生殖中心就诊的不孕症患者，行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）过程中的质量较差、不适宜移植的、在体外受精后培养2～3 d的胚胎。不孕原因为输卵管性、子宫内膜异位症、多囊卵巢综合征和男性不育等，共收集63个正常受精胚胎。

二、方法

胚胎取回后即移入酸性磷酸盐缓冲液（PBS，pH2.5）中处理，清除透明带，然后用4%多聚甲醛固定约30 min，应用间接免疫荧光法（IIF）在紫外光线照射下用荧光显微镜检测胚胎细胞表面的荧光强度。一抗为兔抗人EGFR IgG多克隆抗体，二抗为荧光标记的山羊抗兔IgG/异硫氰酸荧光素（FITC）抗体（美国Santa Cluz公司产品）。实验方法参照文献［7］并加以改进。基本步骤：胚胎移入PBS液滴内漂洗3次，移入1∶10山羊封闭血清中作用10 min，再移入一抗中4℃过夜，PBS漂洗3次，移入二抗中37℃作用30 min，PBS洗3次, 用荧光显微镜在紫外光线照射下观察胚胎细胞表面的荧光强度并照相。每个不同发育期胚胎均重复实验7～10次。阴性对照用PBS代替一抗进行染色。

结果

本实验分析的63个正常受精胚胎细胞表面均有荧光染色，阳性率为100%。EGFR存在于人类未受精卵即卵母细胞、受精卵卵裂后的2细胞、4细胞、6～8细胞和10细胞期胚胎细胞表面，呈黄绿色荧光；同时发现，尽管不孕症患者的病因不同，但胚胎细胞表面EGFR的荧光强度无明显变化，可见胚胎细胞的局部细胞膜表面荧光有增强、集中，细胞轮廓清晰可见。图1～3。

图1EGFR在卵母细胞表面的表达，荧光染色呈黄绿色，并可见细胞表面荧光有局部增强。IIF×100

图2EGFR在5细胞期胚胎细胞表面的表达，荧光染色呈黄绿色。IIF×100

图3EGFR在10细胞期胚胎细胞表面的表达，细胞重叠后显示荧光染色增强。IIF×100

讨论

一、EGFR与其配基

EGFR是一种跨膜蛋白受体，相对分子质量为170 000，在结构上分为细胞外区、跨膜区和细胞内区三部分。细胞外区是配基结合区，EGFR与配基结合后通过其自身磷酸化而发挥其生物学作用，对多种组织、细胞有促进增殖和分泌的效应 。有研究报道，HB-EGF、EGF和TGF-α均可与EGFR结合，在人类生殖过程中发挥调节作用，其中HB-EGF参与胚胎着床的直接调节，是胚胎着床期间不可缺少的细胞因子之一^［1］。

二、EGFR的生物学作用

1.EGFR的表达与植入前胚胎发育的关系：本研究结果显示，人类从卵母细胞即开始合成EGFR，并定位于细胞表面，有利于与其配基结合促进胚胎的早期发育^［4,5］。Martin等^［8］报道， HB-EGF能促进人类胚胎细胞表达EGFR，并能明显促进人类体外培养胚胎的生长、发育，提高了胚胎的级别和质量，同时也明显改善了胚胎的孵化率，从而提高了IVF-ET的妊娠成功率。HB-EGF的促胚胎发育作用可能是通过与胚胎表面EGFR结合而实现的。在小鼠植入前胚胎也有EGFR的表达^［7］。Das等^［9］ 也曾报道，HB-EGF在体外可诱导小鼠胚泡EGFR的自动磷酸化，促进胚泡的生长、透明带的孵化和胚泡滋养层细胞的生长。

2．EGFR与胚胎着床的关系：Das等^［9］报道，在小鼠胚泡着床过程中，HB-EGF启动种植窗期子宫腔上皮的粘附反应，而携带EGFR裸基因突变的小鼠胚泡的数目减少，造成着床失败。提示EGFR是胚泡植入所必需的，EGFR缺乏则可导致着床失败。人类植入前胚胎细胞表达的EGFR，可能与配基特别是HB-EGF结合，共同调节人类早期胚胎的生长、发育，并参与胚胎的着床。

(本文图1～3见插页第9页)

本课题受广东省自然科学基金资助（基金编号：970343）

参考文献

1，Stewart CL, Abbondanzo SL, Cullinan EB, et al. Regulation by maternally derived cytokines of pre-implantion development and uterine receptiveness. Contracept Fertil Sex, 1995, 23: 555-561.

2，张丽凤，苏应宽，盖凌，等. EGF受体在子宫内膜、早孕蜕膜及滋养细胞中的表达. 中华妇产科杂志，1999，34：357-359.

3，陈健美，曾文洁，吴佳捷，等. 子宫平滑肌和胎膜组织EGF受体mRNA表达水平与分娩发动的关系. 中华妇产科杂志，2000, 35:29-31.

4，Chia CM, Winston RM,Handyside AH ,et al. EGF,TGF-alpha and EGFR expression in human preimplantation embryos. Evelopment ,1995, 121: 299-307.

5，Smotrich DB, Stillman RJ, Widra EA, et al. Immunocytochemical localization of growth factors and their receptors in human pre-embryos and Fallopian tubes. Hum Reprod, 1996, 11: 184-190.

6，Kim CH, Chae HD, Cheon YP, et al. The effect of epidermal growth factor on the preimplantation development, implantation and its receptor expression in mouse embryos. J Obstet Gynaecol Res, 1999, 25: 87-93.

7，Wiley LM,Wu JX, Harari I, et al. Epidermal Growth Factor Receptor mRNA and Protein Increase after the Four-Cell Preimplantation Stage in Murine Development. Dev Biol,1992,149: 247-260.

8，Martin KL, Barlow DH,<