关键词： 卵巢肿瘤；孕酮；囊腺癌，浆液；脱噬作用；肿瘤细胞，培养的

【摘要】目的探讨孕激素(P)对人卵巢癌细胞株HO8910细胞体外增殖及凋亡的调控作用。方法选用人卵巢癌细胞株HO8910进行体外培养，实验组中加入含不同浓度P的培养液,对照组加入等量空白培养液，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖，流式细胞仪测定细胞周期和凋亡率，光学显微镜和透射电子显微镜进行形态学观察，终末脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)计数凋亡细胞，流式细胞仪间接免疫荧光技术分析细胞内bcl-2蛋白的表达。结果P浓度为1×10^-7～1×10^-5 mol/L时，作用24、48、72 h均明显抑制HO8910细胞的增殖(P均＜0.01)，并具有剂量依赖性。P作用后G₀/G₁期细胞增加，并伴随G₀/G₁期细胞的增加，出现细胞凋亡峰和凋亡率的升高（P＜0.01）；当P浓度为1×10^-6、1×10^-5 mol/L时，作用72 h后的细胞凋亡率分别为10.38%和35.78%,两者比较，差异有极显著性（P＜0.01）。凋亡细胞计数，当P浓度为1×10^-5 mol/L时，8孔中7孔（7/8）为凋亡细胞阳性，明显多于对照组(P＜0.05)。光学显微镜和透射电子显微镜可观察到细胞凋亡的形态学改变。细胞内bcl-2 蛋白表达检测显示，当P浓度为1×10^-6 mol/L时，bcl-2蛋白表达率为61.25%,明显低于对照组的71.07%(P＜0.05)；当P浓度增至1×10^-5 mol/L时, bcl-2蛋白表达率为9.40%，与对照组和P浓度为1×10^-6 mol/L时比较，差异均有极显著性（P＜0.01）。结论P对卵巢癌细胞株HO8910细胞的增殖具有明显抑制作用，呈现剂量-效应关系。P的这种抗癌作用与诱导细胞凋亡有关，抗凋亡基因bcl-2 蛋白表达下降可能是诱发细胞凋亡的机理之一。

The Effect of Progesterone on Proliferation and Apoptosis in Ovarian Cancer Cell

HU Zhuoying, DENG Xiaogu.

（Department of Obstetrics and Gynecology, First University Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China）

【Abstract】ObjectiveTo investigate the regulatory effect of progesterone on proliferation and apoptosis in ovarian cancer cell line HO8910 in vitro. MethodsOvarian cancer cell line HO8910 originated from human ovarian serous cystadenocarcinoma was cultured in vitro. Two groups were set up: study group (progesterone in different concentrations) and control group without progesterone. Cell proliferation was measured by 3-(4,5-dimethylthiazol-z-yl)-2,5-dipheny tertrazolium blue (MTT) colorimetric assay. Cell cycle and apoptotic percentage were detected by flow cytometry, morphological changes of apoptotic cells were observed by light and electron microscopy, and apoptotic cells were quantitatively determined by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). In addition,expression of intracellular bcl-2 protein was analyzed by flow cytometric indirect immunofluorescent technique.ResultsProgesterone of 1×10^-7～1×10^-5mol/L inhibited HO8910 cell growth significantly in a dose-dependent manner （P＜0.01）. After treatment with progesterone, the enhanced G₀/G₁ arrest was accompanied with the enhanced apoptotic peak and percentage, as well apoptotic cells were found more than those in control group (P＜0.05). By light and electron microscopy, there were many morphological characteristics of apoptosis including compaction and margination of nuclear chromatin, nuclear fragments, and apoptotic bodies. Analysis on expression of intracellular bcl-2 protein showed that progesterone could down-regulate bcl-2 protein and at concentration of 1×10^-5mol/L it could almost block bcl-2 expression. ConclusionsIt is suggested in the present study that progesterone can inhibit the proliferation of epithelial ovarian cancer cells in vitro and there is an accordant dose-response relationship. Its anticancer effect seems to be due to induction of apoptosis which maybe a result of down-regulation of the anti-apoptotic protein bcl-2.

【Key words】Ovarian neoplasms; Progesterone; Cystadenocarcinoma, serous; Apoptosis; Tumor cells, cultured

细胞凋亡受阻或缺陷是形成肿瘤的机理之一，设法促进细胞凋亡是治疗肿瘤的方向。细胞凋亡和细胞增殖一样，可受到某些生长因子和激素的调节^［1］。卵巢癌的激素疗法是否通过诱导细胞凋亡而起作用，目前国内外报道很少。本研究采用多种检测手段，观察孕激素(P)对卵巢癌细胞株HO8910细胞体外增殖及凋亡的影响，以期寻找治疗卵巢癌的有效的辅助措施。

材料与方法

一、材料

卵巢癌细胞株HO8910来源于人卵巢浆液性囊腺癌，由中国科学院上海细胞生物所提供。P和四甲基偶氮唑蓝（MTT）均为美国Sigma公司产品。 细胞凋亡检测试剂盒终末脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)为德国宝灵曼公司产品。鼠抗人bcl-2 单克隆抗体、异硫氰酸荧光素（FITC）标记羊抗鼠IgG抗体购自北京中山生物技术公司。

二、方法

1.细胞的培养:HO8910细胞培养方法参见文献［2］。

2.细胞增殖的测定：按上述培养方法得到的HO8910单细胞悬液，以每孔6×10³个细胞加入96孔培养板中，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，第2天待大部分细胞贴壁后4℃培养1 h，以促成细胞同步化生长^［2］；换培养液，实验组加入不同浓度的P，每孔20 μl，使其终浓度分别为1×10^-8、1×10^-7、1×10^-6、1×10^-5mol/L，每一浓度均设8个平行孔，对照组(下同)加入20 μl空白培养液。继续培养24、48及72 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(浓度为5 mg/ml)，轻振培养板，放回培养箱内再孵育4 h后，吸尽上清液，每孔中加二甲亚砜200 μl，振荡器上振荡5～10 min， 用酶标光度计在波长为580nm时测定每孔的吸光度(A)值。 每个实验均重复3次。

3.细胞周期和细胞凋亡率的测定：将浓度为3×10⁴个/ml的HO8910细胞接种于培养瓶中，同步化处理后换培养液，实验组分别加P至终浓度为1×10^-7、1×10^-6、1×10^-5mol/L。继续培养72 h后收集细胞，70％乙醇固定，碘化丙啶染色后置流式细胞仪 (FCM，美国can Becton Dickison公司生产)分析。细胞凋亡率为（凋亡细胞数／总细胞数）×100%，共计数500个细胞。

4.细胞的形态学观察：（1）光学显微镜观察：将浓度为3×10⁴个/ml的H08910细胞悬液接种于24孔培养板中，每孔1ml， 孔内已预置盖玻片，待细胞生长至对数生长期，换培养液，实验组分别加入浓度为1×10^-6、1×10^-5mol/L的P，，培养72 h后取出盖玻片，瑞氏染色10～15 min，光学显微镜下观察。（2）细胞超微结构观察：上述方法培养72 h后收集细胞，固定、包埋、切片、染色，采用Hitachi-600透射电子显微镜（日本日立公司生产）观察。

5.细胞凋亡的测定：接种细胞于置盖玻片的24孔培养板，实验组P浓度为1×10^-6、1×10^-5mol/L，各设8个平行孔。培养72 h后，取出盖玻片，4％多聚甲醛固定，按TUNEL试剂盒说明进行操作，光学显微镜观察凋亡细胞。细胞核呈棕褐色着色者为阳性凋亡细胞，阴性者细胞核呈蓝色。根据阳性凋亡细胞数的多少分为，每低倍镜视野中有阳性凋亡细胞但少于总数1/3者为(+)，1/3～2/3者为(++)，大于2/3者为(+++)，并计算各组凋亡细胞的阳性率。凋亡细胞阳性率为（阳性凋亡细胞孔数／总孔数）×100%。

6.细胞内bcl-2蛋白表达的测定：细胞培养同TUNEL法，收集约1×10⁶个HO8910细胞，多聚甲醛室温固定15 min。加入按1∶50稀释的鼠抗人bcl-2单克隆抗体20 μl，4℃冰浴1 h。每组均设空白对照，即以磷酸盐缓冲液代替一抗。加入异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG抗体 20 μl，4℃暗处孵育30 min。置FCM检测。

三、统计学方法

采用SAS统计软件对计量资料进行方差分析，用Student-Newman-Keuls(SNK)法进行两两比较。计数资料用χ²检验和四格表确切概率法。

结果

一、HO8910细胞的增殖情况

MTT比色法检测P对HO8910细胞的增殖作用，结果见表1。浓度为1×10^-8 mol/L时，细胞生长受到轻度抑制,但与对照组比较,差异无显著性（P＞0.05）。当浓度为1×10^-7～1×10^-5 mol/L时，对细胞生长有明显的抑制效应，与对照组比较，差异均有极显著性(P＜0.01)。在每一时间段，随着<