β-地中海贫血是我国南方常见的常染色体隐性遗传性疾病。目前常用聚合酶链反应（PCR）检测基因已知点突变的方法进行产前诊断。而对β-地中海贫血进行基因诊断最有效的方法主要有反向点杂交法^［1］和扩增不应突变系统（amplification refractory mutation system, ARMS）技术^［2］。我们应用ARMS技术完成了1例有β-地中海贫血的快速产前基因诊断，现报道如下。

一、资料与方法

1．资料：患者因第1胎生育β-地中海贫血患儿，现又妊娠第2胎而来我室遗传咨询门诊就诊，要求产前诊断。第1胎曾在湖南医科大学附属湘雅医院诊断为“β-地中海贫血”，于1岁多死亡。父母双方表型均正常。

2．方法：（1）DNA抽提：静脉血或脐血DNA的提取：抽取父母静脉血各5 ml或在B超指导下抽取胎儿（于妊娠21周左右）脐血2 ml，肝素抗凝，放入50 ml离心管中，加入5～10倍体积的1×全血裂解缓冲液，冰育30 min，以3 000 r/min离心10 min，弃上清液，再加入3 ml 核裂解缓冲液，混匀，加入300 μl 12烷基磺酸钠和10 μl蛋白酶K（20 mg/ml），55℃消化3～5 h或37℃消化过夜，应用常规酚/氯仿抽提法提取DNA。羊水DNA的提取：抽取胎儿脐血的同时再抽取羊水15 ml（两者对照实验），放入50 ml离心管中，3 000 r/min离心10 min，弃上清液，再于沉淀中加入3 ml的核裂解缓冲液，混匀，同上加入12烷基磺酸钠和20 μl蛋白酶K，余下步骤基本同静脉血或脐血DNA的提取。（2）ARMS引物：5种［CD41-42（-4bp）、IVS-2654（C→T）、CD17（A→T）、-28（A→G）和CD71-72（+A）］β-地中海贫血点突变引物^［3，4］，由上海生物工程公司合成。其中N为正常序列引物；M为突变序列引物；C1、C2为共同引物，分别与N或M配合。（3）PCR扩增：10 μl反应体系中包含如下成分：模板DNA 0.6 μl，2.5 mmol 4种脱氧核糖核苷酸混合物共1 μl, 25 mmol Mg⁺⁺ 0.8 μl,10×缓冲液1 μl，20 μmol引物各0.15 μl，Taq DNA聚合酶（购自上海生物工程公司） 0.15 μl（4U/μl）。在PE9600 PCR扩增仪上完成PCR扩增，条件如下： 95℃预变性1.5 min后，94℃ 40 s，60～65℃ 25～35 s，72℃ 25～35 s，共完成32～35个循环，72℃ 延伸5 min，最后置4℃保温。

3．电泳检测：每管中加入6×载样缓冲液2 μl，混匀后点样于2% 的琼脂糖凝胶（0.5 μg/ml 溴化乙啶）,100 V电泳40 min，紫外透射仪观察结果并照像。

二、结果

1．基因诊断结果：经5对C1/N或C2/N引物PCR扩增后，产生了5条分别对应于CD71-72（+A），CD41-42（-4bp），CD17（A→T），-28（A→G）和IVS-2654（C→T）突变的543 bp，463 bp，250 bp，121 bp和817 bp的正常扩增带；同时经C1/M或C2/M引物PCR扩增后，丈夫和妻子还分别产生了1条对应于CD41-42（-4bp）和IVS-2654（C→T）突变的463 bp和817 bp?的突变扩增带。因此，丈夫和妻子分别是CD41-42（-4bp）?和IVS-2654（C→T）的突变杂合子，均为β-地中海贫血基因突变携带者。见图1。

1～5分别为正常人珠蛋白基因位点CD17(A→T)、-28(A→)、CD41-42(-4bp)、CD71-72(+A)和IVS-2654(C→T)的正常引物ARMS检测；通道6和7分别为丈夫的位点CD41-42(-4bp)正常引物和突变引物的ARMS检测；8和9分别为妻子的位点IVS-2654(C→T)正常引物和突变引物的ARMS检测

图15个位点的ARMS检测

2．产前基因诊断结果：对夫妻双方均为基因携带者的β-地中海贫血高危胎儿进行了羊水和脐血的产前基因诊断，发现只有经5对C1/N或C2/N引物PCR扩增后产生的5条分别对应于位点CD71-72（+A），CD41-42（-4bp），CD17（A→T），-28（A→G）和IVS-2654（C→T）突变的543 bp，463 bp，250 bp，121 bp和817 bp的正常扩增带； 而经C1/M或C2/M引物PCR扩增后，未产生对应于这5个位点突变的任何突变扩增带。因此，胎儿的产前基因诊断结果完全正常，可以继续妊娠。分娩的男婴，经随访并抽提其DNA样品再验证，与产前诊断结果完全一致。

三、讨论

Newton等^［2］于1989年建立了ARMS技术，是一种较好的检测突变位置的已知方法，在地中海贫血和其他一些遗传性疾病的诊断中得到了广泛应用。ARMS技术的原理是在DNA序列一端的可能点突变处设计两个引物，突变位点位于引物的3′末端，1个是相应于正常基因等位序列的引物，1个是相应于突变基因等位序列的引物，再在DNA另一端设计一个共同引物，用PCR对突变基因进行检测，因此也叫等位基因特异性PCR^［2，3］。我们应用ARMS技术，成功地对1例β-地中海贫血患者进行快速、准确的产前基因诊断。现小孩1岁半，发育正常。本文所检测的这5种突变，占我国β珠蛋白基因突变的93.3%^［4］。反向点杂交虽然是一种有效检测β-地中海贫血的方法，但是操作繁琐、费用昂贵，不利于在基层推广应用和在地中海贫血高发区的大规模人群筛查及携带者的检出^［4］；也不利于已生育1胎地中海贫血患儿且已死亡、无法行该患儿的基因诊断，而在患儿父母的基因突变位点又未知的情况下，又冒昧地妊娠了第2胎要求产前基因诊断者。我们应用上述报道的5种基因突变，同时对父母和胎儿进行ARMS检测，快速进行基因诊断和产前基因诊断。整个过程在两天内完成。

多重PCR的成功与许多因素有关，例如引物设计、各个引物的比例、PCR条件等。虽然位点CD71-72（+A），CD41-42（-4bp），CD17（A→T）和-28（A→G）之间相距较近，进行ARMS时可以共用一个C1引物而进行多重等位基因特异性PCR检测，但是在我们进行ARMS时发现，如果引物的比例或条件不准确，有些产物带会出现假阴性结果；多重PCR所加引物相对较多，且位点-28（A→G）PCR产物仅121bp，靠近引物二聚体，较高浓度的琼脂糖电泳难以把PCR产物及二聚体分开；而且位点IVS-2654（C→T）不能与其他位点一起进行多重等位基因特异性PCR。从而给实验的成功带来了困难。我们的经验是，行基因诊断时，由于时间充余，可以考虑多重PCR，或者与普通PCR并用；而行产前基因诊断时，最好是不使用多重PCR，以节约时间尽快出诊断报告，以决定胎儿的取舍，减轻患者和家属的精神和生理上的痛苦。

参考文献

1，周玉球，徐湘民，李文典，等.β-地中海贫血患者的婚前筛查及产前诊断.中华妇产科杂志，1998， 33：109-110.

2，Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, et al. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res, 1989,17:2503-2516.

3，毛跃华，孙琼，李争，等.应用多重等位基因特异性PCR技术进行β-地中海贫血的基因诊断.中华医学遗传学杂志，1995，12：209-211.

4，杜传书，曾瑞萍，任晓琴，等.用ARMS法检测β-地中海贫血C654-2T突变.中华血液病学杂志，1998，19：544-545.

收稿日期：1999-07-23