关键词： 胎血；树突细胞；囊腺癌，浆液；肿瘤细胞，培养的；免疫疗法

【摘要】目的探讨脐血来源的树突状细胞（DC）的体外诱导及其在抗肿瘤免疫中的作用。方法无菌条件下常规采集脐血， 采用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞，去除悬浮细胞后获得单核细胞。将获得的单核细胞分为两组，实验组₁在含有细胞因子白介素4（IL-4）、粒单细胞集落刺激因子（GM-CSF）和肿瘤坏死因子（TNF-α）的合成培养液DMEM中培养，对照组₁培养液中未加上述细胞因子，第10天收集部分细胞进行细胞表型分析，并与人浆液性囊腺癌细胞株HO9810冻融抗原共同培养48 h后获得DC。将获得的DC与用 E-花环分离脐血单个核细胞得到的T淋巴细胞共同培养3 d，然后分为两组，实验组₂继续与不同比例的HO9810细胞共同培养3 d后获得细胞毒T淋巴细胞（CTL），对照组₂除加入HO9810外，还加入了无关细胞（COS细胞），用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测其对HO9810细胞的抑制作用。结果（1）IL-4、GM-CSF和TNF-α可诱导脐血来源的单核细胞（即DC前体细胞）分化为成熟的DC，10 d后实验组₁分别高表达DC特异性抗原CD1a（37.90±6.60）%、CD40（46.80±3.40）%、CD80（73.50±6.20）%、CD83（50.20±5.40）%和人白细胞二类抗原［HLA-DR，（78.50±15.40）%］，分别与对照组₁比较，差异均有显著性（P＜0.05）。（2）DC可负载肿瘤抗原，并可诱导肿瘤特异性CTL的产生，当实验组₂中 DC与肿瘤细胞的比例达到100∶1时，与对照组₂比较，肿瘤细胞明显受到抑制（P＜0.05）。结论脐血中的DC前体细胞可在体外诱导成为功能性(即成熟)DC；并可诱导肿瘤特异性CTL的产生，是一种临床应用前景良好的、方便有效的肿瘤免疫治疗方法。

In Vitro Studies on Dendritic Cell Derived from Cord Blood and Its Role in Antitumor Immunity

LIU Yan, ZHU Meiqi, ZHANG Hong.

（Department of Obstetrics and Gynecology, Second Affiliated Hospital of Suzhou Medical College, Suzhou 215004, China）

【Abstract】ObjectiveTo investigate the way of inducing dendritic cell (DC) from precursor in cord blood and its role in antitumor immunity. MethodsCord blood was collected under sterile condition and the mononuclear cells (MNCs) were separated by centrifugal in density gradient (Ficoll-Hypaque). The adhesion cells, collected among the MNCs, were cultured with interleukin-4 (IL-4, 50 ng), granulocyte-macrophage colony-stumilating factor (GM-CSF, 100 ng) and tumor necrosis factor α (TNF-α,1～2 ng) in dulbecco′s modified eagles medium (DMEM) medium. Cell phenotype was analyzed on 10 th day with CD1a, CD16, CD14, CD19, CD40, CD56, CD80, CD83, and human leukocyte antigens-D-related (HLA-DR) antibody by using indirect immunofluorescence assays. After cultured with tumor cytolysis antigen for 2 days, the cells were incubated with auto T cell separated by E-rosette formation. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay was employed to test inhibition rate of tumor specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) on HO9810 tumor cell line. ResultsOur results indicated that DC precursors in cord blood can be induced to differentiate and mature in the medium containing IL-4, GM-CSF, and TNF-α. Some DC specialized antigens expressions were seen on 10th day after cultured with cytokines. After incubation with tumor cytolysis antigen, the DC can activate the CTL to become tumor specialized CTL, which had shown significantly inhibition on growth of HO9810 tumor cell line. ConclusionsPrimary in vitro experiment has shown that the precursors in cord blood can be induced to functional DC which activate T lymphocyte to become tumor specialized CTL. Our result indicate that it is an efficient and convenient way in antitumor immunity by inducing DC precursors in cord blood to functional DC and may have a great implication on clinical application.

【Key words】Fetal blood; Dendritic cells; Cystadenocarcinoma, serous; Tumor cells, cultured; Immunotherapy

近来在抗肿瘤免疫的研究中发现，树突状细胞（DC）在抗原的递呈及激活淋巴细胞使其成为肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）方面有重要作用，因而有广泛的应用价值。目前的研究已证明，DC可由造血干细胞及外周血单核细胞等多种细胞诱导而来^［1,2］。我们将分离脐血得到的单核细胞在白介素4（IL-4）、粒单细胞集落刺激因子（GM-CSF）和肿瘤坏死因子（ TNF-α）作用下于体外诱导DC的生成和向成熟分化，并观察其对卵巢癌抗原递呈、激活淋巴细胞产生CTL以及CTL在体外对卵巢癌细胞的杀伤作用。现报道如下。

材料与方法

一、材料来源

正常足月分娩产妇在胎儿娩出后，于无菌条件下取脐血约30～50 ml，肝素抗凝，共收集4份。合成培养液（DMEM及RPMI-1640）为美国Gibco公司产品；IL-4、GM-CSF和TNF-α购自美国Immunogenex公司；培养瓶和培养板购自美国Coring公司；单克隆抗体购自法国Immunotech公司；人浆液性囊腺癌细胞株HO9810购自上海细胞所；无关细胞（COS细胞，是一种用于转基因的包装细胞）为苏州医学院免疫室赠送；淋巴细胞分离液为上海生物化学试剂二厂生产；四甲基偶氮唑蓝（MTT）为美国Sigma公司产品；荧光显微镜为日本Olympus公司生产的BX40型。

二、 实验方法

1. 脐血单个核细胞的分离和DC的诱导： 脐血经Hank液按1∶4稀释后，采用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞，计数后取部分细胞用E-花环分离得到T淋巴细胞，备用；其余细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞浓度为2×10⁵/ml，培养2 h后，去除悬浮细胞，获得单核细胞。DC的诱导方法^［3］简述如下：将上述分离所得的单核细胞分两组接种于24孔板中，每孔1 ml，实验组₁每孔中加入细胞因子IL-4（50 ng）、GM-CSF （100 ng）和TNF-α（1～2 ng），置于含5% 二氧化碳、饱和湿度、37℃培养箱中培养，每3天半量换液1次，并在诱导DC的第10天，在其培养基中加入HO9810冻融抗原（每孔100 μl），致敏48 h，获得DC；对照组₁除未加上述细胞因子外，其余条件均相同。

2.细胞冻融抗原的制备：HO9810细胞置于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中培养5 d后，取对数生长期肿瘤细胞，置于液氮中10 min，再迅速放在37℃水浴中，反复3次，取上清液经微孔滤膜过滤作为肿瘤抗原，4℃保存。

3.细胞表型的测定：应用间接免疫荧光法检测分离脐血得到的单核细胞培养前、后细胞表型的变化，选用的单克隆抗体为 CD1a、CD14、CD16、CD19、CD40、CD56、CD80、CD83及人白细胞二类抗原（HLA-DR，法国Immunotech公司产品）。具体方法为：取培养前、后的脐血单核细胞，每孔1×10⁵～2×10⁵个，分别加入上述单抗，作用30 min，用磷酸缓冲液洗涤2次，再加异硫氰酸荧光二抗，30 min后，磷酸缓冲液洗涤 3次，荧光显微镜检测各细胞表型。

4.CTL诱导及抑制肿瘤的实验：将上述得到的DC与T淋巴细胞按1∶20比例，每孔1×10⁶个细胞，分为两组分别加入24孔板中，37℃、5%二氧化碳培养72 h。实验组₂把经DC激发、诱导的脐血T淋巴细胞（效应细胞），与对数生长期的 HO9810细胞（靶细胞，每孔5×10³个），按效靶比分别为1∶1、10∶1、100∶1，共同培养72 h后获得CTL；对照组₂除加入HO9810外，还加入了COS细胞。取体外诱导的CTL与肿瘤细胞HO9810，按1∶20比例混合，接种于96孔板中，每孔1×10⁴个细胞，分别培养24、48、72、96和120 h，并于培养的最后4 h中加入20 μl MTT溶液(50 mg/ml)，去除上清液，加入100 μl酸化异丙醇（含0.04 mol/L盐酸）彻底溶解蓝色的甲颗粒，用酶标仪在波长为570 nm时测定其吸光度（A）值。肿瘤细胞抑制率=［（对照组₂ A值-实验组₂ A值）/对照组₂ A值］×100%。

三、统计学方法

组间比较采用t′检验和秩和检验，数据用±s表示。

结果

一、 DC的形态学改变和细胞表型分析

1. DC的形态学改变：实验组₁细胞在培养12 h后，可见脐血单核细胞中贴壁细胞呈圆形，培养3 d后观察到细胞体出现树突状突起；第4天后，大多数细胞开始时呈悬浮生长，表现为树突状细胞外形，贴壁细胞呈集落样生长；培养7 d后，细胞均匀分散在培养基中。而对照组₁则未见类似改变，细胞随着培养时间延长，细胞内开始出现颗粒，部分细胞开始裂解。

2. 细胞表型分析：采用间接荧光法对培养10 d后所获的细胞进行表型分析，结果表明，在体外<