【摘要】目的探讨妊娠高血压综合征(妊高征)患者子宫螺旋动脉平滑肌细胞(VSMC)增生与原癌基因c-myc表达的关系。方法应用原位杂交方法对20例血压正常妊娠妇女、11例中度妊高征和18例重度妊高征患者子宫螺旋动脉VSMC的c-myc基因进行检测，同时观察子宫螺旋动脉平滑肌层的组织结构变化。结果中度和重度妊高征患者VSMC c-myc的阳性表达率分别为63.6%(7/11)和72.2%(13/18)，明显高于正常妊娠妇女的25.0%(5/20，P＜0.05)；而中、重度妊高征患者子宫螺旋动脉VSMC的增生率分别为54.5%(6/11)和55.6%(10/18)，明显高于正常妊娠妇女的10.0%(2/20，P＜0.05)。相关分析显示，c-myc的高表达同VSMC增生相关。结论妊高征患者子宫螺旋动脉的c-myc高表达，能导致VSMC的增生，并可能是引发妊高征一系列病理变化的环节之一。

The Study on Correlation of c-myc Expression with Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation in Uterine Spiral Arteries of Pregnancy Induced Hypertension

CHEN Lei, YAO Yuanqing, YANG Menggeng, et al.

Department of Obstrics and Gynecology, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710038,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate c-myc proto-oncogene expression of uterine spiral arteries in pregnancy induced hypertension (PIH) and the relationship of this expression with vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation in uterine spiral arteries of PIH. MethodsForty-nine placental bed biopsies, 29 from women with PIH and 20 from normotensive pregnant women, were taken during cesarean section. The expression of c-myc in uterine spiral arteries was detected and localized by in situ hybridization. Histological changes of placental bed biopsies were evaluated by HE staining. ResultsThe positive rate of c-myc was 63.6% (7/11) in moderate PIH and 72.2% (13/18)in severe PIH respectively. They were significantly higher than that in normotensive pregnancy (P＜0.05,P＜0.01, Fisher exact test). 54.5% (6/11) of moderate PIH and 55.6% (10/18) of severe PIH had VSMC proliferation. This was only 10.0% (2/20) in normotensive pregnancy. It was significantly lower than those of moderate and severe PIH (P＜0.05, P＜0.005, Fisher exact test). In PIH cases the VSMC proliferation in uterine spiral arteries was correlated with higher c-myc expression (chi-square test, P=0.009 3). Conclusionc-myc expression is higher in VSMC of uterine spiral arteries in PIH. VSMC Proloferates obviously in uterine spiral arteries of PIH cases. VSMC proliferation in PIH may be associated with c-myc expression.

【Key words】Pregnancy complications, cardiovascular;Hypertension；Genes, MYC；Muscle, smooth, vascular；Uterus

妊娠高血压综合征(妊高征)是妊娠期特发及常见的疾病，为孕产妇及围产儿死亡的重要原因之一，其病因至今未明。近年的研究发现，妊高征患者的子宫螺旋动脉平滑肌细胞增生，导致动脉管腔狭窄，从而引起子宫胎盘缺血缺氧，是妊高征的一系列病理变化的可能原因之一^［1，2］。c-myc基因参与细胞增殖、分化，被认为是第3信使。以往的研究表明，c-myc的高表达与血管平滑肌细胞 (VSMC) 增生相关^［3］。本研究采用原位杂交方法检测了正常产妇和妊高征患者子宫螺旋动脉VSMC的c-myc基因的表达，同时观察子宫螺旋动脉组织结构变化，旨在了解妊高征患者c-myc基因的表达与子宫螺旋动脉VSMC增生的可能关系，探讨妊高征的发病机理。

资料和方法

一、标本来源

子宫螺旋动脉标本取自本院产科1997年9月～1998年2月49例剖宫产分娩产妇。其中20例为血压正常产妇，年龄(26.9±1.8)岁，孕周(39.6±0.8)周；11例为中度妊高征患者，年龄为(26.3±3.2)岁，孕周(40.0±1.3)周；18例为重度妊高征患者，年龄为(26.4±2.8)岁，孕周(38.6±1.3)周。妊高征诊断标准按文献［4］。

二、方法

1.试剂：c-myc基因片段购自美国癌基因公司。c-myc mRNA的cDNA片段用随机引物法标记，标记方法按说明书进行。Dig DNA Detection Kit 购自德国宝灵曼公司。蛋白激酶K购自美国Sigma公司。

2.子宫螺旋动脉取材和处理：根据Pijnenborg等^［2］的方法。剖宫产时，胎儿和胎盘娩出后，在子宫的胎盘附着的中心部位，以组织钳钳夹子宫壁浅层，切下1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm小块组织，为预防出血，创面常规用铬制肠线缝合1针。取出的组织标本立即置于含0.1%二乙基焦碳酸酯的4%多聚甲醛中固定12～24 h。常规石蜡包埋，全自动组织切片机切片，厚度为4～5 μm。每份标本切片3 张，1张作HE染色，2张作原位杂交。

3.原位杂交：(1)切片处理：组织切片粘附于涂有APES胶的载玻片上，60℃烤箱过夜。切片用二甲苯10 min脱蜡两次，100%、95%、85%、70%乙醇各处理5 min，0.01 mol/L磷酸缓冲液(PBS) (pH=7.4)漂洗5 min，0.2 mol/L HCl酸化10 min，PBS漂洗5 min，5 μg/ml蛋白激酶K 37℃消化10 min。(2)预杂交：加不含探针的预杂交液于组织切片上，42℃预杂交10 min。(3)杂交：98℃变性探针10 min，-20℃冰浴5 min，滴加杂交液于组织切片上，置湿盒中42℃杂交过夜。(4)洗脱：2×SSC振洗5 min，2×SSC 55℃洗30 min，1×SSC 50℃洗15 min，1×SSC室温洗15 min。(5)封闭：buffer Ⅰ 500 μl+Triton X-100 1.5 μl+NSS(正常绵羊血清) 5 μl 37℃处理30 min。(6)探针标记：滴加碱性磷酸酶标记的地高辛抗体复合物，置37℃ 2 h，buffer Ⅰ振洗10 min，buffer Ⅲ平衡组织2 min。(7)显色：显色剂由buffer Ⅲ1 000 μl+四氮唑蓝(NBT)4.5 μl+5-溴-4-氮-3吲噌磷酸盐(BCIP)构成。每张切片加50 μl，置暗处显色30 min到2 h，镜下观察其显色情况，buffer Ⅳ处理5 min以终止反应，蒸馏水洗5 min。(8)衬染：伊红衬染细胞浆，常规乙醇脱水，二甲苯透明树胶封固。(9)结果判定：以细胞浆内有蓝色染色颗粒为阳性细胞。根据染色的阳性细胞数分为4级，即阴性(-)、弱阳性(+)、阳性(++)、强阳性(+++)。每片读3个视野，并将阳性和强阳性的切片统计，计算阳性结果。

4.HE染色：切片用HE染色。以光镜检查子宫螺旋动脉中层平滑肌，记录平滑肌细胞层数和管腔情况。平滑肌细胞层数达4～5层，同时子宫螺旋动脉管腔狭窄甚至闭塞，为子宫螺旋动脉平滑肌增生。

三、统计学处理

采用F检验，比较妊高征患者和正常妊娠妇女c-myc表达阳性率及VSMC增生率。以χ²检验计算c-myc表达同VSMC增生的相关性。采用Sigmastat统计软件进行统计处理。

结果

一、c-myc在子宫螺旋动脉平滑肌细胞中的表达

c-myc mRNA杂交阳性反应物呈蓝色细颗粒状，主要位于子宫螺旋动脉增殖的VSMC细胞浆内。少数位于血管内皮细胞和成纤维细胞浆内。血压正常妊娠妇女c-myc mRNA阳性表达率为25.0%(5/20)，中度妊高征患者为63.6%(7/11)，重度妊高征患者为72.2%(13/18)。结果表明，中、重度妊高征患者c-myc mRNA阳性表达率显著高于正常妊娠妇女(P＜0.05)。而中、重度妊高征患者之间则无差异。

二、子宫螺旋动脉壁的病理变化

正常妊娠妇女子宫螺旋动脉VSMC增生率为10.0%(2/20)，而中度妊高征患者为54.5%(6/11)，重度妊高征患者为55.6%(10/18)。中度和重度妊高征患者子宫螺旋动脉VSMC增生率，显著高于血压正常妊娠妇女(P＜0.05)。而中度与重度妊高征患者之间则无差异。

三、c-myc表达与子宫螺旋动脉VSMC增生的相关分析

χ²检验显示，在中度和重度妊高征患者中，c-myc mRNA阳性表达与子宫螺旋动脉VSMC增生呈相关性，P=0.009 3。

讨论

一、妊高征患者子宫螺旋动脉病理改变的分子生物学机制

1945年，Hertig^［5］首次发现妊高征患者子宫螺旋动脉出现急性动脉粥样硬化，而这种动脉硬化早期变化之一是动脉壁的VSMC的活跃增生。进一步研究发现，妊高征患者子宫螺旋动脉VSMC增生现象比急性动脉粥样硬化更常见，有些患者子宫螺旋动脉只表现为VSMC增生而无粥样硬化，有些只是部分增生。Meekins等^［1］报道，妊高征患者子宫螺旋动脉VSMC增生的检出率为55.0%，与本实验结果接近。妊高征患者子宫螺旋动脉VSMC增生导致动脉管腔狭窄，可缩小至正常的二分之一，甚至闭塞，从而使子宫胎盘缺血缺氧，引发妊高征的一系列病理变化。至于妊高征患者子宫螺旋动脉VSMC增生的原因，国内外尚未见报道。

c-myc属原癌基因，由3个外显子和2个内含子组成。c-myc基因编码核内转录因子，调控细胞的增殖和分化，属立即反应基因。以往的体外实验发现^［3］，c-myc反义脱氧寡核苷酸能降低c-myc mRNA的表达和相应蛋白的水平，同时抑制血管VSMC的增殖。本实验显示