摘要：目的探讨子宫内膜局部免疫微环境对妊娠的影响。方法对19例孕6～9周的正常妊娠和11例正常分泌期妇女，采用流式细胞技术检测蜕膜及内膜的巨噬细胞及自然杀伤(NK)细胞。结果蜕膜组织中巨噬细胞［白细胞分化抗原分化簇(CD)14阳性即CD⁺₁₄］及NK细胞(CD56阳性即CD⁺₅₆)含量较分泌期子宫内膜组织增加，差异有极显著性(P＜0.01)。NK细胞的CD⁺₅₆CD^-₁₆亚群含量增加，差异有极显著性(P＜0.01)，而CD⁺₅₆CD⁺₁₆亚群含量差异无显著性（P＞0.05）。结论子宫内膜巨噬细胞及NK细胞可能参与妊娠子宫对半同种异体胚胎的保护性免疫反应。

Changes of Endometrial Macrophages and Nature Kill Cells during Luteal Phase and Early Pregnancy

HONG Yan

(Department of Gynecology and Obstetrics, Renji Hospital, Shanghai Second University, Shanghai 200001，China)

LIN Qide

(Department of Gynecology and Obstetrics, Renji Hospital, Shanghai Second University, Shanghai 200001，China)

CHEN Zhuping

(Department of Gynecology and Obstetrics, Renji Hospital, Shanghai Second University, Shanghai 200001，China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of endometrial microenvironment on pregnancy.MethodsThe number of macrophage and nature kill (NK) cells in decidua and endometrium were determined in 19 cases of early pregnancy and 11 non-pregnant women respectively by cytometric analysis.ResultsThe percentages of macrophages (leukocyte antigen molecules CD14 positive) and NK cells ( CD56 positive) were significantly increased in decidua of first trimester as compared with those in luteal endometrium （P＜0.O1）.The number of CD⁺₅₆CD^-₁₆ subset of NK cells increased significantly during early pregnancy. While the number of CD⁺₅₆CD⁺₁₆ subset did not change.ConclusionThe endometrial macrophages and NK cells may be involved in the mechanism of the fetal protective immune reaction during pregnancy.

Key words：Endometrium；Antigens, CD14；Decidua；Macrophages；Killer cell, natural▲

在妊娠过程中，母体对同种异体的胚胎抗原的免疫耐受，一直是生殖免疫研究的重点。随着分子免疫学的进展，与胎儿半同种异体抗原组织直接接触的子宫内膜得到越来越多的关注^［1］。对子宫内膜免疫职能细胞功能的研究，主要集中于啮齿类动物模型中，目前的报道仅限于对少数正常妊娠和不明原因难免流产患者子宫蜕膜自然杀伤(NK) 细胞变化的观察^［2,3］。但对正常分泌期及早孕期巨噬细胞，以及分泌期NK细胞的观察、研究尚未见有报道。本实验采用流式细胞技术，对子宫内膜及孕早期蜕膜中的巨噬细胞及NK细胞进行检测，了解子宫内膜局部免疫微环境对人类生殖的影响。

资料与方法

一、研究对象

1.蜕膜组: 19例，为1997年12月至1998年4月，在我院计划生育门诊要求人工流产、孕6～9周的正常妊娠妇女。既往月经规则,无病理妊娠史，本次妊娠期间无阴道异常出血,B超检查提示胚胎发育正常,有胚囊、胚芽及心管搏动。

2.内膜组： 11例,为1997年12月至1998年4月间，就诊于我院门诊正常未孕妇女，其中1例为要求放置宫内节育器的育龄期妇女，10例为男方精液异常的不孕患者，月经史、生殖系统解剖、内分泌及免疫功能等指标均正常。近3个月内无激素类药物使用史,妇科及盆腔检查均正常。

二、方法

1.标本来源：蜕膜组妇女行常规人工流产手术,吸出蜕膜及绒毛组织,识别出绒毛后,取蜕膜组织。内膜组妇女，均于月经第20～29 d取内膜，用特制的内膜活检刮匙取前壁、后壁内膜3～4块。

2.蜕膜和内膜单个核细胞分离:新鲜子宫内膜及蜕膜组织用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗2～3次，除去血凝块,小心去除蜕膜组织中绒毛组织。将洗净的内膜及蜕膜组织放置于金属小筛网中，用眼科小剪刀剪切成1 mm左右的组织块,4℃ PBS淋洗,用一次性注射器橡皮头研磨、挤压，4层纱布过滤,离心浓缩后溶于RIPM1640培养液中，以1∶2体积比平铺于Ficoll淋巴细胞分离液上，蜕膜组织分离以2000 r/min离心20 min；内膜组织分离为1000 r/min离心10 min。取出中间层淋巴细胞于RIPM1640培养液中洗涤2次,蜕膜组织稀释成1～5×10⁶/ml的细胞悬液,内膜组织稀释为1～5×10⁵/ml的细胞悬液。由于所取组织，尤其是内膜组织及部分蜕膜组织较少，故分离获得的单细胞悬液仅能达到一次流式细胞检测的含量，故蜕膜组的19例中仅11例同时进行巨噬细胞及NK细胞检测，2例仅检测NK细胞，6例仅检测巨噬细胞。内膜组中仅1例同时进行巨噬细胞及NK细胞的检测，其余10例随机分别进行巨噬细胞及NK细胞的检测。

3.巨噬细胞的荧光染色及流式细胞仪检测：取100 μl细胞悬液，加入10～20 μl异硫氰酸荧光素-白细胞分化抗原分化簇(CD)14单克隆荧光抗体标记(剂量为20 μl抗体/5×10⁵个细胞)，4℃孵育40 min。PBS(含0.5％小牛血清)洗涤2次,用200 μl 1%的甲醛固定,300码滤网过滤后，用流式细胞仪检测。

4.NK细胞的荧光染色及流式细胞仪检测：取100 μl细胞悬液，加入10～20 μl异硫氰酸荧光素-CD₁₆单克隆荧光抗体及藻红蛋白-CD₅₆单克隆荧光抗体，进行双标记(剂量均为20 μl抗体/5×10⁵个细胞)，4℃孵育40 min。PBS(含0.5％小牛血清)洗涤2次,用200 μl 1%的甲醛固定,300码滤网过滤后,用流式细胞仪检测。

5.主要检测指标:内膜与蜕膜组织中巨噬细胞即CD₁₄阳性(CD⁺₁₄)细胞百分比(%)，CD⁺₅₆CD^-₁₆细胞亚群百分比(%)和CD⁺₅₆CD⁺₁₆细胞亚群百分比(%)。NK细胞(CD⁺₅₆细胞)百分比(%)=CD⁺₅₆CD^-₁₆细胞亚群百分比(%) + CD⁺₅₆CD⁺₁₆细胞亚群百分比(%)；CD⁺₅₆细胞亚群比值=CD⁺₅₆CD⁺₁₆细胞百分比(%)/CD⁺₅₆CD^-₁₆细胞百分比(%)。

三、统计学方法

结果以±s表示，对数据进行Student t检验。

结果

1.子宫内膜及蜕膜组织中巨噬细胞的含量：早孕蜕膜组织中巨噬细胞含量为（21.1±6.8）%，与分泌期子宫内膜含量［(7.8±6.9) %］相比，明显增加，差异有极显著性(P＜0.01)。

2.子宫内膜与蜕膜组织中NK细胞的含量：早孕蜕膜与分泌期内膜组织中NK细胞的总量分别为（50.1±13.7）% 与（21.2±5.3）%，两者比较，差异有极显著性(P＜0.01)。早孕蜕膜与分泌期内膜组织中CD⁺₅₆CD^-₁₆细胞亚群含量分别为（47.3±13.5）% 与（17.3±4.7）%，两者比较，差异有极显著性(P＜0.01)； CD⁺₅₆CD⁺₁₆亚群含量分别为（2.8±1.7）% 与（3.9±2.6）%，两者比较，差异无显著性(P＞0.05)。早孕蜕膜与分泌期内膜组织中CD⁺₅₆CD⁺₁₆/CD⁺₅₆CD^-₁₆比值分别为0.062±0.040与0.237±0.179，两者比较，差异有极显著性(P＜0.01)。

讨论

子宫内膜中有丰富的免疫职能细胞，其中最主要的三大细胞群为CD⁺₅₆的NK细胞,CD⁺₁₄的巨噬细胞及T细胞。

一、巨噬细胞对子宫内膜微环境的影响

妊娠后血中高水平的雌激素可促进子宫内膜上皮细胞分泌集落刺激因子-1,引起巨噬细胞向子宫内膜的趋化及聚集^［4］。在妊娠子宫局部性激素及性激素敏感因子的调节下^［5］，巨噬细胞能分泌多种细胞因子，如肿瘤坏死因子α、集落刺激因子-1、前列腺素E₂、白细胞介素-10、白细胞介素-1系统，这些因子调节滋养细胞的代谢及其侵蚀性，维持局部的免疫抑制状态，从而影响胚胎的发育、着床^［4,6,7］。在微生物代谢产物脂多糖的刺激下，巨噬细胞受到孕酮抑制的细胞毒性作用能恢复，起消灭微生物的防护作用^［6］。

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