【摘要】目的探讨人类组织相容性抗原-G(HLA-G) mRNA的表达与不明原因习惯性流产（RSA）的关系。方法用原位杂交的方法检测正常妊娠早期、晚期孕妇胎盘和RSA患者经免疫治疗并成功分娩的胎盘母胎界面处的HLA-G mRNA的表达。结果正常妊娠早期、晚期孕妇胎盘母胎界面均有HLA-G mRNA的阳性表达，阳性表达位于绒毛内（或）外细胞滋养细胞，以及合体滋养细胞的胞浆内。RSA患者免疫治疗后的胎盘均不表达HLA-G mRNA，免疫治疗没有调节HLA-G mRNA表达的作用。结论HLA-G 可能与RSA的发病原因没有直接的关系；与胎儿存活也无直接关系。

Preliminary Study on the Relationship between Human Histocompatibility Leukocyte Antigen-G mRNA and Recurrent Spontaneous Abortion

ZHANG Xiaoying, FAN Lian， XU Lingdi et al.

Shanghai Insititute of Immunology，Shanghai 200025

【Abstract】ObjectiveTo examine the expression of Human Histocompatibility Leukocyte Antigen-G (HLA-G) mRNA in placenta from cases of recurrent spontaneous abortion (RSA) and try to study the relationship between HLA-G mRNA and RSA.MethodsIn situ hibridization was performed on maternal-fetal interface sections of placenta in first trimester, third trimester of normal pregnancy and RSA women who were treated with immunotherapy and had term delivery.ResultsThe positive signal of HLA-G expression were showed in all placentas of nomal pregnant women within villus and cytoplasma of syncytiotrophoblast and cytotrophoblast. However, there is no any HLA-G mRNA signals in placentas of RSA women after immunotherapy.ConclusionsHLA-G mRNA is not the main cause of RSA and there is no direct relations to fetal survival.

【Key words】Histocompatibility antigensAbortion, habitualTrophoblast

人类组织相容性抗原-G(HLA-G)具有限制性分布和非多态性的特点，被认为在母胎免疫耐受中发挥一定的作用^［1，2］。HLA-G表达一旦出现变异，将有可能导致妊娠性疾病。其中不明原因习惯性流产（recurrent spontanous abortion,RSA）是妊娠常见并发症之一。80年代中期，开始使用丈夫淋巴细胞对患RSA妻子进行主动免疫治疗并取得了很好的结果，支持RSA的发生与免疫密切相关^［3］。本研究采用原位杂交的方法，观察RSA患者经免疫治疗后的胎盘母胎界面HLA-G mRNA的表达情况，探讨免疫遗传基因HLA-G与RSA的关系。

材料与方法

一、病例选择

选择10例正常妊娠早期（8～12周）的人工流产胎盘组织、10例正常妊娠足月顺产胎盘组织和4例不明原因习惯性流产患者经免疫治疗成功后顺产的胎盘组织（标本分别来源于上海市第六人民医院，上海医科大学妇产科医院，第二军医大学长海医院及上海市邮电医院）。

二、标本制备

剪取近母体面胎盘新鲜组织1cm×1cm×1cm绒毛蜕膜组织块，立即投入经二乙基焦碳酸盐（DEPC）处理的磷酸缓冲液（PBS，pH 7.2）中漂洗，固定于新配制的4%聚合甲醛，4℃过夜。按常规方法石蜡包埋，连续切片，组织厚度4 μm，载玻片用硅烷处理。

三、研究方法

1．探针标记：用地高辛标记试剂盒，按3′端加尾法标记HLA-G特异性寡聚核苷酸探针。此片段位于HLA-G基因的3′非翻译区（3 940～3 963），长度为23个碱基，核苷酸序列是5′ TG GGC TGG TCT CTG CAC AAA GAG 3′^［4］，由上海生物工程公司合成。具体操作方法按药盒说明进行。

2．原位杂交：杂交前所有步骤中所使用的容器、称量器、搅拌器等物品均需在180℃烤箱内干烤3小时; 用于试剂配置及漂洗的双蒸水须用DEPC处理并高压灭菌; 实验操作时需带手套，口罩，帽子，严防外源性RNA酶引起胎盘组织中的RNA的丧失。室温下切片入二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，DEPC水浸浴。稀盐酸（0.1 mol/L HCl）处理5分钟，0.1 mol/L PBS洗3次后，蛋白酶K（40 μg/ml）37℃处理10分钟，4%聚合甲醛/PBS固定，再依次用0.1 mol/L甘氨酸/PBS、0.25%乙酸酐/0.1 mol/L三乙醇胺、2×标准柠檬酸钠（SSC）漂洗。然后滴加杂交液于切片上，杂交液含 50%去离子甲酰胺,10%葡聚糖硫酸酯,1×Dehardt′s(葡聚糖Ficoll 400,吡咯烷酮,小牛血清)，10 mmol/L三羟基氨基甲烷氯化氢(pH 8.0)，0.3 mmol/L NaCl，1 mmol/L乙二胺四乙酸二钠(pH 8.0)，0.25 mg/ml变性鱼精DNA,地高辛标记的寡聚核苷酸探针200 ng/ml。每切片含20 μl左右，上盖石蜡膜，42℃，湿盒中过夜。第2天依次在4×SSC/0.05%十二烷基磺酸钠（SDS）、1×SSC/0.05% SDS、1×SSC、0.5×SSC溶液中37℃漂洗。然后用0.05 mol/L PBS冲洗3次，并将抗体封闭液（1%小牛血清，0.4%Triton, 0.05 mol/L PBS）滴加到切片上，15分钟后滴加碱性磷酸酶联接的抗地高辛抗体溶液，4℃孵育过夜。第3天将玻片转入各漂洗液漂洗，依次为0.05 mol/L PBS，TSM1 (0.1 mol/L三羟基氨基甲烷氯化氢，pH 8.0；0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L MgCl₂)，TSM2（0.1 mol/L三羟基氨基甲烷氯化氢，pH 9.5；0.1 mol/L NaCl，5 mmol/L MgCl₂)，漂洗在室温中进行。最后，将显色液NBT/BCIP(450 μg/ml溴基四咄氮蓝、175 μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐与TSM2的混合液)滴加到切片上，暗环境中显色,镜下观察。当显色适度时以0.05mol/L PBS冲洗终止反应。乙醇脱水，二甲苯透明树脂封片。

3．结果判断：（1）阴性对照：用RNAse A预处理标本，浓度为20ug/ml，37℃ 30分钟。（2）阳性判断：细胞浆出现蓝紫色沉淀，（+）、（++）、（+++）表示为阳性反应信号(即表达)，少于（+）或无着色为阴性反应(即无表达)。

结果

一、正常妊娠早期胎盘HLA-G mRNA的表达

10例妊娠早期胎盘组织均有HLA-G mRNA阳性反应，大部分为（++）～（+++）的强阳性反应。阳性反应位于绒毛内细胞滋养细胞、绒毛外细胞滋养细胞以及合体滋养细胞的细胞浆内，呈蓝紫色沉淀，轮廓清晰，周围背景浅淡；绒毛内间质细胞、血管内皮细胞以及蜕膜基质细胞无HLA-G mRNA阳性反应（图1）。

图1显示妊娠早期胎盘HLA－G mRNA阳性（＋＋），

呈蓝紫色沉淀状，分布于绒毛内细胞滋养细胞及合何滋养细胞；

绒毛内间质细胞无HLA－G mRNA信号。化学显色法×1600

二、正常妊娠晚期胎盘HLA-G mRNA的表达

10例正常妊娠晚期胎盘组织均有HLA-G mRNA阳性反应，大部分为（+）～（++）的阳性反应。阳性反应位于绒毛外细胞滋养细胞和部分合体滋养细胞的细胞浆内（图2）。

图2显示妊娠晚期胎盘HLA－G mRNA阳性（＋），

呈蓝紫色沉淀状，分布于部分合体滋养细胞和绒毛外细胞滋养细胞内，

与妊娠早期相比，信号稍弱。化学显色法×800

三、RSA患者免疫治疗成功后顺产胎盘组织HLA-G mRNA的表达情况

4例胎盘组织均为HLA-G mRNA阴性反应，即没有任何HLA-G表达（图3）。

图3 显示RSA治疗后的胎盘上HLA－G mRNA阴性。化学显色法×1600

讨论

一、 HLA-G与母胎免疫的关系

HLA，是个体遗传学上的“身份证”，在群体中具有高度多态性。组织排斥反应就是受者免疫系统识别非己HLA(也称移植抗原)后，HLA-I类抗原限制的CD⁸⁺T淋巴细胞在II类抗原限制的CD⁴⁺T淋巴细胞协助下进行的。妊娠期胎儿对母体来讲是同种异体抗原，其带有的父源HLA可以刺激母体免疫系统产生细胞参与的免疫排斥反应，但实际上这类反应并没有发生。为什么母体免疫系统能接纳含有外来抗原的胎儿而不引起排斥反应？这是生殖免疫学家研究的热点，虽有各种假说，但依据<