【摘要】目的探讨雌激素与三苯氧胺对子宫内膜癌bcl-2癌基因的调节机理。方法采用逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)法，检测子宫内膜癌细胞雌激素受体(ER)阳性RL-952细胞中bcl-2 mRNA表达水平，及其与雌激素和三苯氧胺作用后的变化。结果ER阳性RL-952细胞有bcl-2 mRNA表达。经10^-12、10^-10、10^-8、10^-7 mol/L 17-β-雌二醇(E₂)与RL-952细胞作用72小时后，bcl-2与β-actin mRNA的比值分别为6.94±0.03、7.15±0.02、7.47±0.01、8.44±0.01，呈逐渐升高趋势；经10^-8、10^-7、10^-6、10^-5 mol/L三苯氧胺与RL-952细胞作用72小时后，bcl-2与β-actin mRNA的比值分别为3.62±0.03、2.87±0.01、2.23±0.01、1.98±0.02，呈逐渐下降趋势。结论雌激素可通过促进bcl-2的表达，抑制细胞凋亡，在ER阳性的子宫内膜癌发病中起了一定作用；三苯氧胺则降低bcl-2的表达水平，促进细胞凋亡，可能产生治疗子宫内膜癌的效应。

The Regulation of Estrogen and Tamoxifen to bcl-2 Oncogene

in Endometrial Carcinoma

LAI Dongmei^*, ZHU Guanzhen, ZHOU Jianping, et al.

^* Zhongshan Hospital of Shanghai Medical University,Shanghai 200032

【Abstract】ObjectiveTo study the regulation mechanisms of bcl-2 oncogene in endometrial carcinoma.MethodsA reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) method was utilized to quantitate bcl-2 mRNA levels which regulated by estrogen(17-β-estradiol) and tamoxifen in estrogen receptor (ER)(+) RL-952 endometrial carcinoma cells.Resultsbcl-2 mRNA level was detected in ER(+) RL-952 cells. 17-β-estradiol stimulated a concentration-dependent increase in bcl-2 mRNA level, while tamoxifen lead to a concentration-dependent decrease in bcl-2 mRNA level.Conclusionsbcl-2 oncogen expression in ER(+) endometrial carcinoma is regulated by estrogen and antiestrogen. Estrogen may up-regulate the cell bcl-2 level to inhibit cell apoptosis,while tamoxifen may down-regulate the cell bcl-2 level and induce apotosis.

【Key words】Endometrial neoplasmsGenes, bcl-2 Estrogens Tamoxifen

子宫内膜癌是女性常见的生殖道恶性肿瘤，内源性或外源性雌激素的长期刺激，是子宫内膜癌发病的重要原因。但是雌激素刺激腺上皮生长以致癌变的分子生物学机理仍不清楚。本研究采用体外实验的方法，研究雌激素与三苯氧胺对子宫内膜癌细胞株bcl-2癌基因的调节，以探讨子宫内膜癌发生的机理。

材料与方法

一、细胞株与试剂

1. 子宫内膜癌细胞株：子宫内膜癌细胞株雌激素受体（ER）阳性(+) RL-952细胞由上海医科大学妇产科医院提供，其胞浆及胞核ER(+)。

2. 试剂：17-β-雌二醇(E₂)和三苯氧胺等为美国Sigma公司产品，RNA抽提试剂盒购自美国Promega公司，bcl-2引物及β-actin引物由上海植物生理研究所研制。

二、方法

1. 细胞培养与RNA抽提：ER(+)RL-952细胞按常规方法培养于RPMI-1640培养液中(含15％小牛血清)，0.25％胰蛋白酶消化传代，分成等量接种入50ml培养瓶中，分为对照组和实验组，接种48小时后，更换培养液。实验组加入17-β-E₂或三苯氧胺，使其终浓度分别为10^-12、10^-10、10^-8、10^-7mol/L或10^-8、10^-7、10^-6、10^-5 mol/L，对照组及实验组每一剂量接种细胞各3瓶，置于5％二氧化碳培养箱(37℃)培育72小时后，按Promega公司试剂盒要求进行RNA抽提。

2. 逆转录(RT)反应：将待测RNA3μl，寡dT 1 μl，无RNA酶去离子水12μl依次加入eppen-dorf(Ep)管中，70℃反应5分钟，再加入5×逆转录酶缓冲液5μl，dNTP混合物(10mmol/L)2μl，RNA酶抑制剂(40U/ μl) 1μl，M-MLV逆转录酶(200 U/ μl) 1μl，42℃反应1小时，95℃灭活逆转录酶5分钟，0～5℃放置5分钟，-20℃短暂冻存。

3. 聚合酶链反应(PCR)：在Ep管中依次加入10×PCR反应缓冲液5μl， MgCl₂(25mmol/L) 3μl ，dNTP混合物(10mmol/L) 1μl，bcl-2(20μmol/L)上、下游引物各1μl，β-actin (20μmol/L)上、下游引物各1μl，Tag聚合酶(5U/μl)0.2μl， cDNA模板2μl，加无菌双蒸水至总反应体积50μl。加1滴石蜡油后移至PCR扩增仪行PCR扩增。95℃ 45秒，65℃ 45秒，72℃ 2分钟，循环35次，72℃ 7分钟，4℃保存。扩增产物在2％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上电泳，以PCR相对分子质量标准为参照物，置紫外灯下，通过密度扫描成像仪进行DNA条带光量子强度分析。

三、统计学处理

本研究数据以平均数±标准差(±s)表示，采用EPI INFO统计软件对数据进行方差分析及相关分析。

结果

一、 RL-952细胞RNA RT-PCR扩增产物

17-β-E₂ 和三苯氧胺作用后，RL-952细胞RNA RT-PCR扩增产物见图1，2。bcl-2 mRNA的RT-PCR产物为385bp，β-actin为198bp。

M：相对分子质量标准1：10^-12(单位：mol/L，

下同)2：10^-103：10^-84：10^-7

117-β-E₂作用后RL-952细胞RNA RT－PCR扩增产物

M：相对分子质量标准1：10^-8(单位：mol/L，下同)

2：10^-73：10^-64：10^-5

2三苯氧胺作用后RL-952细胞RNA RT－PCR扩增产物

二、 17-β-E₂作用后RL-952细胞中bcl-2 mRNA

17-β-E₂作用后，RL-952细胞bcl-2 mRNA有一定的表达，经10^-12、10^-10、10^-8、10^-7 mol/L 17-β-E₂作用72小时后，其bcl-2与β-actin mRNA的比值分别为6.94±0.03、7.15±0.02、7.47±0.01和8.44±0.01，呈逐渐升高的趋势，与对照组(6.44±0.01)相比,差异有极显著意义(P＜0.01)。经相关分析，RL-952细胞bcl-2与β-actin mRNA的比值与17-β-E水平的对数值呈正相关（γ＝0.93），两者比较，差异有显著意义(P＜0.05)。

三、三苯氧胺作用后RL-952细胞中bcl-2 mRNA表达水平

RL-952细胞与10^-8、10^-7、10^-6、10^-5 mol/L三苯氧胺作用72小时后，其 bcl-2与β-actin mRNA的比值分别为3.62±0.03、2.87±0.01、2.32±0.01、1.98±0.02，与对照组(6.44±0.01)相比，呈逐渐下降的趋势，两者比较，差异有非常显著意义(P＜0.01)。经相关分析，RL-952细胞 bcl-2与β-actin mRNA的比值与三苯氧胺浓度的对数值呈负相关（r＝0.90），两者比较，差异有显著意义(P＜0.05)。

讨论

bcl-2癌基因是与细胞凋亡关系极为密切的基因之一，它可通过抵抗多种方式的细胞死亡，延长细胞的寿命，使细胞数目累积增多而促进肿瘤形成^［1］。有学者应用免疫组化法，在子宫内膜癌和乳腺癌中检测出bcl-2的存在，并发现其表达水平与ER和孕激素受体（PR）相关^［2,3］。有关雌激素与bcl-2关系的研究发现，ER(+)的乳腺癌细胞株中，雌激素能促进bcl-2 mRNA及其蛋白表达，而在ER(-)的乳腺癌细胞株中则无此作用^［4-6］。

一、雌激素对RL-952细胞bcl-2 mRNA的调节作用

本研究采用RT-PCR法，以β-actin为内源性参照物，对子宫内膜癌细胞中bcl-2 mRNA进行了半定量分析。其中bcl-2与β-actin引物序列特异性高，无交叉反应，而且可在同一管中同时扩增两个不同长度的片段，从而使因反应条件不同而引起的误差减小到最低程度，结果稳定、可靠，与有关文献报道一致^［4,5］。本研究结果表明，随着17-β-E₂浓度的增加，RL-952细胞bcl-2 mRNA水平升高，呈剂量依赖反应，提示雌激素能促进bcl-2的表达（即上调作用）。而对ER(-)的子宫内膜癌细胞株的研究发现，雌激素不能促进其增殖^［7］。可见雌激素与ER相结合是其发挥作用的一个重要条件。