【摘要】目的探讨异位子宫内膜细胞的凋亡特性及雌二醇(E₂)、孕酮（P）、米非司酮对体外培养的人异位子宫内膜细胞表皮生长因子受体(EGFR) 基因表达的影响。方法对15例子宫内膜异位症（内异症）患者的异位内膜组织（异位内膜组）及11例非子宫内膜异位症患者的在位内膜组织（在位内膜组）进行体外细胞培养，采用流式细胞术检测两组细胞的细胞凋亡指数，同时应用原位杂交方法检测细胞中bcl-2的表达水平。应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术，分析12例内异症患者异位内膜细胞在单纯加入培养液（对照组）及在培养液中分别加入E₂(10nmol/L)（E₂组）、P(100 nmol/L)(P组)或P (100 nmol/L) + 米非司酮(1000 nmol/L)(P+米非司酮组)作用后，异位子宫内膜细胞中EGFR mRNA的表达水平。结果异位内膜组的凋亡指数为（2.74±1.54）％，显著低于在位内膜组的（9.97±1.26）％(P＜0.05)。异位内膜组中bcl-2表达阳性颗粒的积分吸光度值为7.26±0.42，明显高于在位内膜组的5.67±1.39(P＜0.05)。与对照组EGFR基因表达的积分吸光度值（0.90±0.10）比较，E₂组（1.10±0.19）及P组（1.28±0.24）均显著增高（P＜0.01），P+米非司酮组（0.63±0.11）的表达则明显降低（P＜0.01）。结论(1)异位子宫内膜细胞通过抗凋亡基因bcl-2的高表达而抑制细胞的凋亡过程，延长生命周期；(2)E₂、P可促进异位内膜细胞的增生及分化，米非司酮则抑制这一过程。

Investigation of the Apoptosis and Proliferation in Endometriotic Cells

GAO Ying^*, LUO Lilan, HE Fuxian.

^*Union Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430032

【Abstract】ObjectiveTo clarify whether apoptosis is involved in endometriosis and the effects of estradiol, progesterone and mifepristone on the expression of epidermal growth factor receptor(EGFR) in cultured human endometriotic cells.MethodsApoptosis index and bcl-2 gene expression were examined in cultured ectopic endometrial cells from women with endometriosis (n= 15 samples) and compared with eutopic endometrial cells from non-endometriosis cases(n = 11 samples).Apoptotic cells were detected by flowcytometry; bcl-2 gene expression demonstrated by in situ hybridization technique. The cultured endometriotic cells were stimulated by estradiol(E₂,10 nmol/L), progesterone(P,100 nmol/L), and P + mifepristone(P 100 nmol/L + mifepristone 1000 nmol/L) respectively for 5 days, the expression of EGFR mRNA of endometriotic cells were determined by reverse transcript polymerase chain reaction (RT-PCR) method.ResultsThe apoptosis index was significantly decreased in the ectopic endometrial cells ［(2.74±1.54)％］ as compared to eutopic endometrial cells ［(9.97±1.26)%］ (P＜0.05). bcl-2 expression in endometriotic cells was significantly increased compared with the eutopic endometrial cells (P＜0.05). The expression of EGFR mRNA in E₂, P group was 1.10±0.19 and 1.28±0.24 respectively, which were significatly higher than that of control(0.90±0.10, P＜0.01). In P+ mifepristone group it was 0.63±0.11, significantly lower than that of control(P＜0.001). ConclusionThe resistance of endometriotic cells to apoptosis may be fundamental in the aetiology and (or) pathophysiology of endometriosis. Estradiol and progesterone promote hyperplasia and differentiation of endometriotic cells while mifepristone inhibits.

【Key words】Endometriosis ApoptosisGenes, bcl-2Receptors, epidermal growth factor-urogastrone

近年来,人们已逐渐认识细胞凋亡对维持细胞平衡生长的重要作用^［1］，子宫内膜异位症（内异症）异位内膜细胞的生长特性可能与细胞凋亡的改变有关。许多研究表明，表皮生长因子是卵巢甾体激素作用于其靶组织的重要介质^［2］。为探讨细胞凋亡与内异症的关系，我们对离体培养的异位内膜细胞的细胞凋亡指数及其抗凋亡基因bcl-2的表达水平进行了检测。同时通过测定雌二醇(E₂)、孕酮(P)及P受体拮抗剂米非司酮对体外培养的异位内膜细胞表皮生长因子受体（EGFR）基因表达的影响，了解异位内膜组织生长调节的机理。

资料与方法

一、研究对象

选自1997年4月至11月在同济医科大学附属同济医院行手术治疗的内异症患者15例，平均年龄29岁（26～34岁），术前3个月内无激素用药史。手术均在增殖期及分泌早期进行，术中取典型的异位病灶组织（盆腔腹膜、腹壁及卵巢异位灶）（异位内膜组），立即置入冰冷、无菌、含青霉素及链霉素的平衡溶液（Hank溶液）中送入实验室。所取组织均经病理学诊断证实。同时取11例同时期非内异症患者的在位子宫内膜组织（在位内膜组），处理方法相同。

二、方法

1．组织处理及细胞培养：异位及在位内膜细胞的培养方法参照Ryan等^［3］报道的方法，将组织尽量剪碎（直径小于1 mm×1 mm），加入0.1％胶原酶溶液混匀后于37℃、5%二氧化碳培养箱中放置120～150分钟。将消化后的细胞悬液（含有内膜腺细胞及间质细胞）种植在25 ml的培养瓶或含有细胞小玻片的小瓶中，加入培养液置入37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，在MEM培养基(美国Gibco公司产品)中加入10％小牛血清、2%谷氨酰胺、20 mmol缓冲液、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素。24小时后倒去未贴壁细胞继续培养，间隔2～3天换液。对原代细胞于光镜下(×200倍)观察形态及生长情况。

2．细胞凋亡指数检测：采用流式细胞术检测。细胞培养5～7天（细胞全部或大部分融合），用0.25％胰酶消化、Hank溶液洗涤后，加入预冷的70％乙醇固定，调整样品中细胞数为1×10⁵个/ml，存放于4℃冰箱待检(时间不超过1个月)。检测时将备检的细胞悬液离心、洗涤后，加入碘化丙锭染色液(20 ng/ml)，同时加入RNA酶(50 U/ml)，于室温不透光处孵育30分钟后，检测每份样本，计数为1×10⁴个细胞。检测结果通过计算机处理分析各参数，得出以百分数表示的细胞凋亡指数。

3.bcl-2表达的检测：采用原位杂交方法。将培养的细胞用4％聚合甲醛(pH 7.4)室温下固定20分钟，经梯度乙醇脱水后置-70℃保存备用。bcl-2杂交探针由同济医科大学免疫室提供，用地高辛标记及检测试剂盒（德国Boehringer Mannheim公司产品）进行检测。在光镜下（×200倍）,异位内膜与在位内膜组选取20个细胞，用TJTY-300型全自动图像发现仪测定细胞内杂交颗粒的平均吸光度值。

4. 异位内膜细胞EGFR表达的测定：原代细胞全部或大部分融合后，用0.1％胰蛋白酶消化传代，2～3天细胞融合后分为4组：①对照组：单纯MEM培养液培养；②E₂组：在培养液中加入终浓度为10 nmol/L的E₂；③P组：在培养液中加入终浓度为100 nmol/L的孕激素；④P+米非司酮组：在培养液中加入终浓度为100 nmol/L的P及终浓度为1000 nmol/L的米非司酮。继续培养5天。（1)各组总EGFR RNA的提取、鉴定：用一步法RNA提取试剂盒(美国Gibco公司产品)提取细胞总RNA。各组RNA经甲醛变性凝胶电泳后，在紫外观测仪上均可见清晰的28、18及5亚单位3个条带。波长为260～280nm处的吸光度比值均保持在1.9以上，根据吸光度值计算出总RNA浓度。（2)EGFR引物设计及建立内参照：设计EGFR基因引物cDNA序列^［4］，上游引物为：5′AGCTCACGCAGTTGGGCACT3′，下游引物为5′TCTCATGGGCAGCTCCTTCA3′，扩增片段长304 bp。β²微球蛋白(β²MG)在所有细胞膜上均能高表达，表达相对恒定，很少受其他因素的影响。因此，选用β²MG作为内参照，矫正加样误差。β²MG引物序列为5′CCACTGAAAAAGATGAGT-AT-3′，5′CTTC- AACCTCCAGATGCTG3′，扩增片段长120 bp。（3)逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）条件及产物测定：试剂盒购自美国Promaga公司。对定量模板RNA在同一体系中完成mRNA转录成cDNA及cDNA的PCR扩增，用EGFR及β²MG的下游引物作为逆转录的引物。反应的模板量均为10 ng，反应程序：42℃、48分钟(逆转录)，94℃、2分钟(cDNA变性)；PCR条件：变性为94℃、30秒，退火为60℃、60秒，延伸为68℃、120秒，循环30次，最后延伸为68℃、7分钟。PCR反应结束取10 μl产物在2％琼脂糖凝胶中电泳（50V）1小时，溴化乙锭染色，全自动图象分析仪测定紫外线下各电泳条带的灰度值，计算出β²MG/EGFR的灰度比值，即为异位细胞EGFR mRNA的表达水平。

三、统计方法

实验结果均以±s表示，用方差分析及t检验进行统计处理。

结果