【摘要】目的探讨豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)和γ-干扰素(γ-IFN )在卵巢癌及其他肿瘤治疗中的意义。方法用PMA+γ-IFN处理的卵巢癌细胞及其他肿瘤细胞用流式细胞仪检测免疫球蛋白超家族糖蛋白的共刺激分子B_7-1、主要组织相容抗原(MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ）的表达情况。并采用⁵¹铬(⁵¹Cr) 4小时释放试验及^［3H］胸腺嘧啶渗入法了解B_7-1的表达对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性和对T淋巴细胞增殖的诱导情况。结果预先用PMA处理，后用γ-IFN处理的肿瘤细胞，能诱导B_7-1表达阳性的伯基特淋巴瘤细胞株或转染 B_7-1基因的卵巢粘液性囊腺癌细胞的B_7-1表达增强，能诱导无 B_7-1、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表达的卵巢癌细胞株及其他肿瘤细胞株表达 B_7-1及MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ，而单独用γ-IFN则不能诱导 B_7-1表达。PMA和γ-IFN的这种协同效应能被蛋白激酶抑制剂1-( 5 -磺酰基)异喹啉-2 -甲基哌嗪盐酸盐(H7)阻断。被诱导表达的 B_7-1能激活CTL的杀伤活性，并能增强T淋巴细胞的增殖能力。结论γ-IFN诱导的B_7-1的表达可能依赖于PMA预先激活蛋白激酶C。诱导B_7-1等的表达对治疗肿瘤有一定的价值。

Phorbol-12-myristate-13-acetate and Interferon-γ Synergistic Induction of B_7-1 Expression in Ovary Carcinoma Cells and Immunological Value

ZHAO Xia, WEI Yuquan, PENG Zhilan, et al.

Department of Obstetrics and Gynecology, Second University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041

【Abstract】ObjectiveTo investigate the therapeutic potential of phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA) and interferon-γ(IFN-γ) by induction of expression of adhesion molecule in mucious cystadenocarcinoma of ovary(MCAS) and other tumor cells.MethodsExpression of costimulatory signals(B_7-1), major histocompatibility complex(MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ) was analysed with flow cytometry. Cytotoxic T lymphocytes(CTL) killing activity and T cell proliferation induced with expression of B_7-1 were evaluated by 4-h⁵¹Cr release assay and standard³HTdR incorporation and scintitation counting. ResultsPretreatment with PMA and then treated with IFN-γ was able to enhance B_7-1 expresssion on the tumor cell lines with the constitutive B_7-1 expression or on B_7-1-transfected tumor cells and to induce B_7-1 expression on MCAS and some tumor cell lines without constitutive B_7-1 expression. However, treament with IFN-γ alone failed to induce B_7-1 expression on the tumor cell lines. The synergistic effect of PMA combined with IFN-γ in the induction of B_7-1 expression can be anatagonised by H7 ［1-(5-isoquinolinesulfonyl)-2-methyl-Piperazine dihydrochloride］. In addition, treatment with PMA combined with IFN-γ simultaneously induced or enhanced the expression of MHC class Ⅰ/Ⅱ on these tumor cell lines. The tumor cells treated by PMA combined with IFN-γ were able to induce CTL killing activity and T cell proliferation, which is involved in the expression of B_7-1.ConclusionsThe enhancement or induction of B_7-1 expression by IFN-γ may be dependent on the prior activation of protein kinase by PMA and the induced B_7-1 expression on tumor cells may have some therapeutic potential.

【Key words】Interferon type ⅡAntigens, CD80T-lymphocytesLymphocyte transformationPhorbol myristale acetate

T淋巴细胞是人体抗肿瘤的主要免疫细胞，它的活化除需要组织相容抗原（MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ）递呈的特异性肿瘤抗原外，还需要共同刺激信号。免疫球蛋白超家族糖蛋白的共刺激分子B_7-1在激活T淋巴细胞免疫过程中是传递关键性共同刺激信号的分子^［1-4］。我们以前的研究也表明，转染 B_7-1基因的肿瘤细胞能有效地激活 T淋巴细胞介导的抗肿瘤免疫反应^［5］。

本研究观察了豆蔻酰佛波醇乙酯（phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA)和γ-干扰素(interferon-γ，γ-IFN)诱导B_7-1和其他免疫分子在卵巢癌细胞及其他肿瘤细胞上的表达情况，探讨应用PMA和γ-IFN在肿瘤免疫效应中的意义。

材料和方法

一、材料

1.肿瘤细胞株：卵巢粘液性囊腺癌细胞株(MCAS)、伯基特淋巴瘤细胞株(Raji)、急性T淋巴细胞白血病细胞株( Molt-4)，由日本癌学会细胞库提供。卵巢浆液性囊腺癌细胞株（LM-1）、及转染B_7-1基因的MCAS细胞株，由日本京都大学放射线生物研究中心建立。

2.其他试剂：γ-IFN购于美国Mallinckrodt公司，蛋白激酶 C (PKC)、PMA 和1-(5-磺酰基)-异喹啉-2-甲基-哌嗪盐酸盐( H7 )等购于美国Sigma公司。

二、方法

1.T淋巴细胞的制备：取卵巢癌患者及健康人外周血，用肝素抗凝，集蔗糖梯度离心法分离，得到富含淋巴细胞的单个核细胞，经覆盖有血清的塑料平板吸附和尼龙网柱去除单核细胞和B淋巴细胞，得到的游离淋巴细胞，用 30%和 40%的硅化聚乙酰胺吡咯烷酮行非连续的梯度离心后，即得到静止T淋巴细胞。

2.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备：预先用PMA (50 nmol/L)处理24小时，再加入γ -IFN (100 U/ml)处理 24小时的卵巢癌细胞，或未经处理的卵巢癌细胞，经丝裂霉素（ 50μg/ml)处理1小时灭活。将1×10⁵个灭活后的卵巢癌细胞与1×10⁶个T淋巴细胞加在1 ml含有10% 小牛血清 (FCS)的RPMI-1640培养液中，接种于24孔平底组织培养板内。阻断实验用抗B_7-1单抗 ( 5μg/ml)和对照抗体抗CD7单抗进行。培养6天之后，得到扩增的 CTL。

3.T淋巴细胞杀伤活性的计算方法：用标准4小时⁵¹铬(⁵¹Cr)释放试验分析，详见参考文献［6-7］。

4.T淋巴细胞增殖反应的检测方法：用^［3H］胸腺嘧啶（³HTdR）渗入法测定，详见参考文献［6-7］。

5.流式细胞术：用美国Becton Dickinson公司生产的流式细胞仪检测B_7-1、MHC-I、MHC-Ⅱ在肿瘤细胞上的表达。

三、统计学方法

本研究资料的统计学分析采用t检验。

结果

一、PMA+γ-IFN对表达B_7-1肿瘤细胞的作用

单独用PMA处理表达B_7-1的Raji细胞24～48小时，能稍增强B_7-1的表达，而单独用γ-IFN处理不能增强 B_7-1在Raji细胞上的表达。但先用PMA (50 nmol/L)处理24小时，再加入γ-IFN(100U/ml)处理24小时，能明显增强 B_7-1在Raji细胞上的表达，平均荧光强度可增至2倍。用PMA+γ-IFN处理Raji细胞与单用PMA或单用γ-IFN处理Raji细胞比较B_7-1的荧光强度，差异均有极显著性（P＜O.01）。这种效应与PMA的使用剂量相关。在诱导转染有 B_7-1基因的MCAS细胞株B_7-1的表达时，也可得到类似的结果。

二、PMA+γ-IFN对未表达B_7-1肿瘤细胞的作用

MCAS、LM-1和Molt-4细胞株经流式细胞仪检测未发现B_7-1的表达。用PMA (1～200 nmol/L)单独处理这些细胞24～48小时，可不同程度诱导出B_7-1的表达。而先用PMA (1～200 nmol/L)处理24小时，后用γ-IFN(100U/ml)处理24小时时，这些细胞表达B_7-1的强度进一步增加。这种效应与PMA的使用剂量相关。用PMA+γ-IFN或单用PMA处理各组肿瘤细胞与未处理组比较B_7-1的荧光强度，差异均有极显著性(P＜0.01)。见图1。

图1PMA+γ-IFN诱导MCAS细胞B_7-1的表达

三、H7对PMA+γ-IFN的作用

H7不影响固有的B_7-1在Raji细胞和转染有B_7-1的MCAS细胞上的表达，但抑制PMA +γ-IFN诱导的B_7-1的表达。

四、PMA+γ-IFN对MHC-I、MHC-Ⅱ的诱导作用

MCAS、转染B_7-1的MCAS和LM-1不表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ，Raji和Molt-4不同程度地表达MHC-Ⅰ，仅Raji细胞表达MHC-Ⅱ。PMA +γ-IFN能诱导上述几种表达MHC-