【摘要】目的研究逆转录病毒介导的p16基因对人卵巢癌细胞系CAOV3生长与致瘤性的抑制作用。方法应用脂质体介导法，将外源性野生型p16基因转染不表达p16的人卵巢癌细胞系CAOV3,对转染后细胞DNA、RNA和蛋白进行分析并观察其生物学行为变化。结果外源性野生型p16基因已整合于细胞并获稳定表达,表达有外源p16基因的细胞生长速度、集落形成率及裸鼠致瘤性均有部分抑制。细胞周期分析可见G₁期增加,S期下降。电镜下超微结构出现生长抑制特征。结论p16基因可明显抑制癌细胞生长，在卵巢癌发生、发展的过程中起重要作用。

Study About the Inhibitory Effects of Retrovirus-mediated p16

Gene on Human Ovarian Cancer Cell Line

WANG Min^*, JIANG Sen, KONG Beihua

^* The Second Clinical College, China Medical University, Shenyang 110003

【Abstract】ObjectiveTo study the inhibitory effects of retro-virus-mediated p16 gene on human ovarian cancer cell line CAOV3. MethodsRecombinant eukaryotic expression vector pDOR-p16 containing exogenous human wt-p16 cDNA and vector with neomycin resistance gene only were introduced by lipofectamine-mediated gene transfection into CAOV3 cell line which does not express p16 endogenously.By using revert-polymerase chain reaction amplification，mRNA in situ hybridization and immunocytochemistry,the clones obtained were detected for their efficiency of transfection and effects of vector expression and observed for their biologic behavior. ResultsExogenous wt-p16 had successfully been transferred into CAOV3 cells and obtained permanent expression. The growth rate of these transfected CAOV3 cells in regular medium and soft agar was inhibited, and the tumorigenicity in nude mice showed that two in four mice failed to form tumor and the others suffered from tumor later than contrast group by 7 to 14 days. The percentage of phase G₁ cells increased and that of phase S cells decreased by analysing cell cycle. The ultrastructural changes of the cells were observed under electron microscope, revealing necrosis and growth retardation. Conclusionsp16 gene played an important role&127;in generation and development of ovarian carcinoma. This study might provide the experimental evidence for the gene therapy in human ovarian cancer.

【Key words】Ovarian neoplasmsGenes， p16Transfection Gene therapy

根据目前研究报道,多数学者认为p16基因异常与卵巢癌的发生、发展有重要关系。本研究应用外源性野生型p16 cDNA转染不表达p16的人卵巢癌细胞系CAOV3,以探讨p16基因治疗卵巢癌的可能性。

资料和方法

一、材料

人卵巢癌细胞系CAOV3由中国医科大学细胞生物实验室提供,为人卵巢浆液性囊腺癌细胞。构建有p16 cDNA重组逆转录病毒真核表达载体pDOR-p16及空载体pDOR，由第四军医大学生化教研室惠赠。脂质转染试剂购于美国Life公司。兔抗人p16多克隆抗体、原位杂交试剂盒、链菌素生物蛋白-过氧化酶免疫组化试剂盒均为美国Santa Cruz公司产品,购于北京中山生物技术有限公司。

二、方法

1.质粒提取及纯化、酶切鉴定:按卢圣栋^［1］推荐的方法进行。

2.细胞培养:CAOV3细胞贴壁生长在含10%～15%胎牛血清及青、链霉素的RPMI-1640培养基中。本研究中的抗药性克隆筛选及扩大培养、细胞生长速度测定、瓶壁集落及软琼脂集落形成试验，均在5% CO₂浓度、饱和湿度及37℃培养条件下进行。

3.p16基因鉴定:应用聚合酶链反应(PCR)法扩增、mRNA原位杂交和免疫细胞化学法对人卵巢癌细胞系CAOV3 p16基因进行检测。p16基因第1、2外显子引物、PCR反应体系及条件参照Kamb等^［2］的方法。生物素随机引物法标记p16 cDNA探针用于p16 mRNA原位杂交,具体步骤参照卢圣栋^［1］推荐的方法进行。

4.p16基因转染及筛选:通过脂质体介导,将pDOR-p16及pDOR转染CAOV3细胞,具体操作参照脂质转染仪说明书及Felgne等^［3］的方法进行。氨基糖甙抗生素(G₄₁₈)筛选浓度为400～600μg/ml,维持浓度为200～300μg/ml。

5.转染基因后鉴定外源p16基因:采用常规酚/氯仿抽提法，提取CAOV3-pDOR-p16、CAOV3-pDOR及CAOV3 3组细胞DNA,PCR扩增p16基因第2外显子,方法同参考文献［2］。

应用mRNA原位杂交及免疫细胞化学法，检测p16在3组细胞中的表达。并将3组细胞分别于倒置相差显微镜、透射电镜及扫描电镜下进行形态学观察。

6.细胞生长曲线及生长速度测定:按鄂征^［4］推荐的每日进行细胞计数并绘制生长曲线。采用结晶紫比色法^［5］测定细胞生长速度。瓶壁集落和软琼脂集落试验，方法同参考文献［4］。

7.流式细胞仪(FCM)检测:3组细胞经0.25%胰酶消化；磷酸缓冲液洗涤；70%冷乙醇固定；碘化丙锭染色30分钟后，应用FCM检测细胞核DNA含量。每个样品检测20 000个细胞,用多功能软件系统分析测定结果。

8.裸鼠致瘤性分析:3组细胞各约5×10⁶/ml接种于4～6周BALB/c裸鼠背部皮下,每组4只裸鼠。连续观察肿瘤出现的时间和大小。根据公式:平均直径=最长直径+最短直径/2,计算肿瘤大小。

结果

一、pDOR-p16的酶切鉴定

pDOR-p16经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切后,1.5%琼脂糖电泳显示2条DNA带,其大小分别为6.5 Kb、0.45 Kb,符合其物理图谱^［6］。

二、CAOV3细胞系p16基因检测情况

对5种人卵巢癌细胞系DNA进行PCR扩增,结果CAOV3扩增无产物,凝胶电泳时不出现相应的带型。对CAOV3 p16 mRNA和蛋白进行原位杂交和免疫细胞化学检测,结果CAOV3即无p16 mRNA表达,也无p16蛋白表达,证明CAOV3 p16基因为纯合性缺失。

三、基因转染细胞及其筛选情况

通过脂质体介导分别将pDOR-p16及pDOR转染CAOV3细胞,观察与未经转染的癌细胞在G₄₁₈中生长情况。结果可见细胞受到外源性基因转染后,在G₄₁₈环境中生长受到抑制,在第7天细胞开始死亡脱落,在第13天形成克隆,继续增加G₄₁₈用量,至第21天形成的克隆继续生长,CAOV3-pDOR形成的克隆数为(196±14)个,CAOV3-pDOR-p16形成的克隆数为(51±14)个，明显较转染空载体形成的克隆数少,说明p16基因能抑制卵巢癌细胞生长。未经转染的CAOV3在G₄₁₈中逐渐死亡,最终全部脱落。

四、p16基因在细胞内的整合及表达

用p16基因第2外显子引物对3组细胞提取的DNA进行PCR扩增,结果可见在CAOV3-pDOR-p16细胞中扩增出300 bp大小的产物,而CAOV3-pDOR及CAOV3细胞却无相应的片断被扩增。表明在重组表达载体转染的G₄₁₈抗性细胞基因组DNA中，整合有p16cDNA的目的基因。

免疫细胞化学及mRNA原位杂交结果可见，CAOV3-pDOR-p16细胞内有大量的红色(mRNA)及棕黄色(蛋白)颗粒,而CAOV3-pDOR及CAOV3细胞则为阴性,均未检测到p16mRNA及蛋白表达(图1，2)。进一步表明外源性p16基因已转入细胞并整合于细胞的基因组中。

五、细胞形态学改变

转染基因72小时后，3组细胞在相差显微镜下可见CAOV3-pDOR-p16细胞形态有改变,由长梭形变成短梭形或圆形。扫描电镜下可见CAOV3及CAOV3-pDOR细胞相似,细胞群集,多为长梭形,突起明显,表面微绒毛长且多。CAOV3-pDOR-p16细胞则较分散,细胞变成短梭形或圆形,细胞光滑,突起少,表面微绒毛少且稀疏。透射电镜下可见CAOV3-pDOR-p16细胞超微结构出现生长抑制特征,即细胞变大,线粒体增多,轻度肿大,内质网减少,溶酶体及脂滴增多。

六、基因转染后细胞生长速度

基因转染后，CAOV3-pDOR-p16细胞生长数量较CAOV3-pDOR及CAOV3细胞明显减少(图3)，速度减慢(表1)；CAOV3-pDOR-p16细胞的瓶壁集落和软琼脂集落形成数量均少于CAOV3-pDOR及CAOV3细胞。说明p16基因能抑制癌细胞生长。

图3CAOV3，CAOV3-pDOR,CAOV3-pDOR-p16细胞生长曲线

表1p16基因对卵巢癌细胞生长速度的影响(570mm,