【摘要】目的探讨妊高征患者胎盘中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)含量减少的原因。方法采用定量的逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)技术，检测9例正常足月妊娠妇女胎盘和12例妊高征患者胎盘中eNOS-mRNA转录强度的变化。结果(1)正常足月妊娠妇女胎盘和妊高征患者胎盘中均存在eNOS-mRNA。(2)妊高征患者胎盘中eNOS-mRNA的转录强度显著低于正常足月妊娠妇女(P＜0.05)。结论妊高征患者胎盘中eNOS含量的减少是由于eNOS-mRNA转录强度下降所致。

The Changes and Significance of the Intensity of Transcription of Endothelial Nitric Oxide Synthase-mRNA in Placental Tissue from Cases of Pregnancy Induced HypertensionZhou rong, Li Weimin, Cao Zeyi, et al. Second Affiliated Hospital, West China University of Medical Sciences， Chengdu 610041

【Abstract】ObjectiveTo determine the cause of decreasd expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in placental tissue from cases of pregnancy induced hypertension (PIH). Methods9 placentae of normal pregnant women and 12 placentae of patients with PIH were studied. eNOS-mRNA was measured in placental tissue by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results(1)There was eNOS-mRNA in placental tissue of normal pregnancy as well as PIH cases. (2). The intensity of transcription of eNOS-mRNA in placental tissue of PIH cases decreased significantly when compared with that of normal pregnancy (P＜0.05). ConclusionThe decrease of the intensity of transcription of eNOS-mRNA in placental tissue of PIH patients may result in reduction of expression of eNOS in placental tissue of PIH.

【Key words】 Nitric oxide synthase Pregnancy campications, cardiovascularHypertension RNA，Messenger Transcription,genetic

妊高征是导致孕产妇和围产儿患病率及死亡率升高的重要原因之一。近年来的研究表明，血管内皮细胞产生的舒张因子——一氧化氮(NO)有维持正常妊娠血管张力和血流速度的作用，NO的改变在妊高征的发病中起重要作用^［1～3］。国外的研究表明，妊高征患者胎盘中一氧化氮合酶(eNOS)的活性显著低于正常妊娠者^［4］；妊高征患者胎盘和正常妊娠妇女胎盘中eNOS含量的表达强度在终末绒毛血管和合体滋养细胞中也有所不同^［5］。本研究采用定量的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测妊高征患者胎盘中eNOS-mRNA转录强度的变化，以探讨eNOS含量减少的原因。

资料与方法

一、观察对象

从1996年9月～1998年2月收集在本院妇产科行剖宫产的孕产妇胎盘共21例。其中正常足月分娩胎盘9例 (孕龄271.48±6.09天)。妊高征患者胎盘12例（孕龄270.24±10.13天）。妊高征诊断按《妇产科学》(第4版)诊断标准^［6］，均为中度及中度以上妊高征患者。剖宫产者均未临产，系因骨盆、胎位或妊高征危及母儿安全等因素而行剖宫产手术。手术时，待胎盘自娩后，立即取其母面正中组织约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm（约重30 mg)，铝箔纸包裹液氮中速冷后，置入-70℃冰箱待用。取材时，注意避开出血、坏死及钙化部位。

二、方法

1.试剂：总RNA提取药盒(德国Qiagen公司产品)；逆转录药盒(美国Gibcobrl公司产品)； eNOS引物^［7］：5′-CAG TGT CCA ACA TGC TGC TGG AAA TTG-3′，5′-TAA AGG AGG TCT TCT TCC TGG TGA TGC C-3′(美国CyberSyn 公司合成)； 内参照引物(β-微球蛋白cDNA):5′-ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA-3′, 5′-ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-3′(购自北京中山生物技术公司)；耐热性DNA聚合酶(TaqDNA酶,美国Gibcobrl公司产品)；标记物123 bp ladders(美国Gibcobrl公司产品)；其余试剂为国产分析纯。

2. 实验方法：总RNA抽提及逆转录严格按照药盒说明书进行。每个样本均取3 μg总RNA进行逆转录。在由总RNA逆转录为cDNA后，取cDNA的10％进行PCR扩增。在PCR反应体系中依次加入10×PCR 缓冲液 5 μl，25 mmol/L MgCl₂ 3 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，eNOS引物1 μl，β-微球蛋白cDNA 2 μl，TagDNA酶0.5 μl及模板cDNA，最后加入适量的超纯水，使终反应体积为50 μl。

在上述反应液面上滴加石蜡油100 μl，于94℃预变性3分钟，随之进行PCR循环,其循环条件为：变性94℃，45秒; 退火55 ℃，90秒；延伸72 ℃，2分钟。共循环30次。最后1次延伸时间为72 ℃，8分钟。PCR产物置于-20 ℃保存。

取PCR产物10 μl，加入溴酚蓝2 μl，在1.2％琼脂糖凝胶上电泳。用UVP 800 Gel Works ID Intermediate 软件系统进行定量扫描，测量其峰值，并同时测量内参照β-微球蛋白cDNA的PCR扩增产物的峰值，以两者的比值作为待测样本的结果。

三、统计方法

两组计量资料作t检验。

结果

一、胎盘中eNOS-mRNA的表达

正常足月妊娠妇女的胎盘及妊高征患者的胎盘组织中均存在eNOS-mRNA。β-微球蛋白cDNA的PCR扩增产物为120 bp，eNOS cDNA的PCR扩增产物为485 bp。

二、胎盘中eNOS-mRNA转录强度的变化

正常足月妊娠妇女胎盘的eNOS-mRNA cDNA的PCR产物扫描强度为1.051 4±0.381 1, 显著高于妊高征患者胎盘的eNOS-mRNA-cDNA的PCR扫描强度(0.479 0±0.132 2，P＜0.05)。

讨论

一、定量RT-PCR反应特点

本研究采用在人体细胞中均存在且稳定表达的β-微球蛋白cDNA作为内参照引物，与样本模板cDNA在同一试管中相同条件下进行扩增，并以样本模板的cDNA的PCR扩增产物与β-微球蛋白cDNA的PCR扩增产物的比值，作为样本模板cDNA的PCR产物量值；同时，规定了用于抽提总RNA的样本胎盘组织的含量、参加cDNA逆转录的总RNA含量以及参加PCR循环的样本模板cDNA含量。这样，就克服了由于实验操作误差所造成的人为因素的影响，从而使结果更具准确性和可靠性。

二、妊高征患者胎盘eNOS-mRNA转录强度变化

本研究发现，在正常足月妊娠和妊高征患者胎盘中均存在eNOS-mRNA，与Boccardo等^［8］的研究结果一致。此外，本研究结果还发现，与正常足月妊娠胎盘相比较，妊高征患者胎盘中eNOS-mRNA转录强度显著下降(P＜0.05)，说明妊高征患者胎盘中eNOS含量的减少，是由于eNOS-mRNA转录强度下降所致。由于eNOS-mRNA转录强度的下降，使以eNOS-mRNA为模板的eNOS的蛋白质翻译减少，eNOS合成下降，造成了由eNOS所催化的内源性NO合成减少，进而导致NO的第二信使环磷酸鸟苷(cGMP)的合成减少^［9］，引起血管平滑肌收缩，血管张力增加，出现妊高征的临床表现。

上述研究结果说明，胎盘中eNOS-mRNA转录强度下降是妊高征的重要发病环节。

参考文献

1Helmbrecht GD, Farhat MY, Lochbaum L, et al. L-arginine reverse the adverse pregnancy changes induced by nitric oxide synthase inhibition in the rat. Am J Obstet Gynecol, 1996,174:800-805.

2Molnar M, Suto T, Toth T, et al. Prolonged blockade of nitric oxide synthesis in grarid rats produces sustained hypertension, proteinuria, thrombocytopenia, and intrauterine growth retardation. Am J Obstet Gynecol, 1994，169:1458-1466.

3Lubarsky SL, Ahokas RA, Friedman SA. The effect of chronic nitric oxide synthesis inhibition on blood and angiotensin Ⅱ responsiveness in the pregnant rat. Am J Obstet Gynecol, 1997，176:1069-1076.

4Morris NH, Saoranna SR, Learmout JG, et al. Nitric oxide synthase activities in placental tissue from normotensive, preeclamptic and growth retarded pregnancies. Br J Obstet Gynecol, 1995，102:711-714.

5Ghabour MS, Eis ALW, Brockman MS, et al. Immunohistochemical characterization of placental nitric oxide synthase expression in preeclampsia. Am J Obstet Gynecol, 1995，173:687-694.

6乐杰主编. 妇产科学.第4版.北京：人民卫生出版社，1996.113-121.

7Garvey EP, Tuttle JV, Covington K, et al. Purification and characterization of the constitutive nitric oxide synthase from human placenta. Arch Biochem Biophy, 1994, 311: 235-241.

8Boccardo P, Soregaroli M, Aiello S, et al. Systemic and fetal-maternal nitric oxide synthesis in normal pregnancy and pre-eclampsia. Br J Obstet Gynecol， 1996，103:879-886.

9刘耕陶. 一