【摘要】目的观察白细胞介素-2(IL-2)基因转导对卵巢癌细胞镜下形态及增殖性的影响。方法构建携带IL-2基因逆转录病毒载体，将IL-2基因导入卵巢癌细胞系SKOV3，观察细胞光镜下的形态和超微结构的变化，测定细胞核分裂相、生长曲线、³H-TdR掺入量及细胞周期。结果以质粒pPSRV/IL-2为模板，聚合酶链反应(PCR)扩增出IL-2 cDNA功能编码区，长490 bp，插入逆转录病毒载体pLXSN构建携带IL-2基因载体pLIL-2SN，包装后导入卵巢癌细胞系SKOV3。培养上清液IL-2活性24小时为30～318 U/10⁶细胞。与亲本细胞相比较，光镜下IL-2基因修饰细胞体积增大、形态趋于一致、核浆比缩小；电镜下IL-2基因修饰细胞质高度空泡化，染色质集聚。SKOV3/IL-2细胞核分裂相减少、生长缓慢，倍增时间由38.4小时延长为65.4小时，³H-TdR掺入量下降52.3%。细胞周期分析显示，细胞阻滞于G₀/G₁期。结论逆转录病毒可有效介导IL-2基因导入卵巢癌细胞，并长期表达；IL-2基因转导可引起肿瘤细胞形态和超微结构的变化，这种改变可能预示肿瘤细胞生物学特性的变化；IL-2基因转导可抑制SKOV3细胞增殖。

Interleukin 2 Gene Transfer on the Proliferation and Morphology of Ovarian Cancer Cell Line SKOV3Zhang Zhenyu, Lang Jinghe. General Hospital of Beijng Military Command, Beijing, 100700

100700

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of interleukin-2(IL-2) gene transfer on the proliferation and morphology of ovarian cancer cell line SKOV3. MethodIL-2 gene was introduced into ovarian cancer cell line SKOV3. The morphologic changes, mitosis, proliferation curve,³H-uptaking and cell cycle were studied.ResultsIL-2 cDNA， 490bp, was transduced. IL-2 gene expression was detected. IL-2 activity was 30～318 U/10⁶ cells/24hr. IL-2 gene modified cell is squamas like with smaller nucleus/cytoplasm ratio, lager cell area and more homogeneous. The ultrastructural study showed that the cytoplasma of IL-2 gene modified cells is markedly vacuolized and the chromatin is condensed. There was less mitosis found in SKOV3/IL-2 cells. SKOV3/IL-2 cell proliferate more slowly， the doubling time prolonged from 38.40hr to 65.36hr,³H-uptaking decreased 52.3% of the parent cell. The cell cycle study showed that SKOV3/IL-2 cell was blocked to phase G₁/G₀.ConclusionsThe retrovirous vector can transduce Il-2 gene into ovarian cancer cell line SKOV3 effectly. IL-2 gene transfer can induce morphologic changs of SKOV3 cells, which may indicate the biologic behavior changes of the targets. IL-2 gene transfer can induce the proliferation inhibition of SKOV3 cells.

【Key words】Ovarian neoplasmsInterleukin-2 gene Gene transferCell division

细胞因子基因导入卵巢癌细胞的研究刚刚开展，白细胞介素-2(IL-2)基因转导对卵巢癌细胞生物学特性的影响尚不清楚^［1］。本研究将人IL-2 cDNA导入卵巢癌细胞系SKOV3，建立了IL-2分泌的卵巢癌细胞，初步观察了IL-2基因转导对卵巢癌细胞形态及增殖的影响。

材料与方法

一、携带人IL-2基因逆转录病毒载体的构建

以携人全长IL-2 cDNA质粒(pPSRV/IL-2)为模板，扩增IL-2功能区(pPSRV/IL-2及IL-2引物，均由军事医学科学院基础医学研究所惠赠)具EcoR I和BamH I酶切位点，序列为：P1∶5＇GGGAATTCACAATGTACAGGATGCAACTC 3＇；P2∶5＇GGGGATCCGGGAAGCACTTAATTATCAAGTTA 3＇。

逆转录病毒载体pLXSN(军事医学科学院基础医学研究所二室提供)及IL-2聚合酶链(PCR)反应片段分别经EcoR I和BamH I酶切、去磷酸化，加T₄噬菌体DNA连接酶(Promega公司产品)后温育，取连接反应产物转化感受态大肠杆菌，挑选单菌落扩增鉴定。

二、携IL-2基因载体的包装及病毒滴度测定

1.转染：将脂质体与质粒溶液混合，转染包装细胞PA317，经G 418筛选2～3周，采用有限稀释法将G 418抗性细胞单克隆化。

2.病毒滴度测定：收集1×10⁶对数生长期IL-2基因修饰PA317细胞的24小时培养上清液，将其按1∶10、1∶100、1∶1 000稀释，取1 ml稀释液转染3T3细胞，经G418筛选2～3周后，记数阳性集落数。每个集落代表一个具有感染能力的病毒，病毒滴度计算公式为：

病毒滴度(CFU/ml)=阳性集落数×病毒上清稀释倍数×10

三、包装细胞的鉴定

以基因修饰PA317细胞的基因组DNA为模板，进行PCR反应，扩增外源基因片段Neo基因和IL-2基因。循环参数：94℃变性1分钟，55℃复性1分钟，72℃延伸1分钟，共35个循环，反应结束后72℃延伸7分钟，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。Neo基因引物(由军事医学科学院基础医学研究所惠赠)跨越349bp，序列为：P1: 5' TCCATCATGGCTGATGCAATGCGGC 3'；P2: 5' GATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCG 3'。

四、IL-2基因导入SKOV3细胞及IL-2活性测定

1.转染：将1×10⁵对数生长期SKOV3细胞接种于25 cm²培养瓶，待80%细胞融合时，取2 ml包装细胞病毒上清液（含8 μg/ml Polybrene）与对数生长期SKOV3细胞共同培养，经G418筛选，采用有限稀释法获取单细胞，并扩增。

2.IL-2活性测定：采用IL-2依赖细胞CTLL-2活性测定法，参见文献［1］。活性计算公式为：

活性单位 =(样品达 50% 增殖的稀释倍数)/(标准品达 50% 增殖的稀释倍数)×

标准品第1孔IL-2活性单位

五、免疫组化ABC法及逆转录-PCR检测SKOV3细胞IL-2基因的表达

1.ABC法：支持物培养法制备细胞铺片标本，参照随试剂盒提供的操作说明进行ABC染色（试剂盒购于华美公司）。阳性细胞胞浆呈棕色。

2.逆转录(RT)-PCR：采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA^［2］，应用mRNA纯化试剂盒(购于Promega公司)分离细胞mRNA，以其为模板合成cDNA第1条链（逆转录试剂盒购于Promega公司）。以逆转录反应产物为模板进行PCR，扩增IL-2、Neo基因mRNA。循环参数：94℃变性1分钟，55℃复性1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环。反应结束后72℃延伸5分钟。

六、细胞形态观察

制备细胞铺片标本，吉姆萨染色，光镜下观察细胞形态特征。电子显微镜观察收集待测细胞，常规固定，PHILIPS透射与扫描电镜观察。

七、测定细胞生长曲线

参照李秀森^［3］的方法进行甲基噻唑基四唑(MTT)测定。共测定5天，绘制细胞生长曲线。各组数据进行直线回归分析，求得回归方程，推算细胞倍增时间，进行各组细胞生长曲线斜率差异的显著性检验。

八、³H-TdR掺入实验

参照文献［1］进行，1×10⁴细胞接种24小时后加入25 μCi/ml³H-TdR 20μl（中国原子能研究所提供），培养16小时后收集细胞，测定放射强度。

九、细胞周期分析

收集对数生长期细胞(1～2)×10⁶，于4℃、70％乙醇固定至少24小时。检测前去除固定液，经RNA酶消化，溴化丙锭（Sigma公司产品）避光染色;调整细胞浓度为1×10⁶/ml，经300目尼龙网，上机测定，每个样品测定10 000个细胞。

结果

一、携带IL-2基因逆转录病毒载体的构建

以质粒pPSRV/IL-2为模板，PCR扩增出IL-2 cDNA功能编码区，长490 bp，与载体pLXSN连接成功，将其命名为pLIL-2SN。

二、包装细胞病毒滴度及鉴定

转染空载体者病毒滴度最高为3.2×10⁵ CFU/ml，命名该克隆为PA317/Neo，转染pLIL-2SN者病毒最高滴度为1.75×10⁵ CFU/ml，命名该克隆为PA317/IL-2。分别以PA317/IL-2、PA317/Neo细胞染色体基因组DNA为模板，以Neo、IL-2基因引物扩增相应的外源基因，PA317/Neo细胞可扩增出Neo基因，而PA317/IL-2细胞既可扩增出Neo基因片段，又可扩增出IL-2基因片段。

三、IL-2基因导入SKOV3细胞及IL-2活性测定

命名pLXSN修饰的SKOV3细胞为SKOV3/Neo，pLIL-2SN修饰的SKOV3细胞为SKOV3/IL-2。采用有限稀释法将SKOV3/IL-2细胞单克隆化并扩增，共获得8个单克隆。培养上清液IL-2活性最高者每24小时为318U/10⁶细胞，现已传38代，历时5个月，IL-2表达量下降为每24小时30U/10⁶细胞。ABC法显示SKOV3/IL-2 细胞胞浆呈棕色，为强阳性，有IL-2表达。RT-PCR显示，