【摘要】目的研究子宫肌瘤组织中孕激素受体(PR)基因的表达情况，从PR基因的转录及翻译水平探讨米非司酮治疗子宫肌瘤的作用机理。方法采用Northern印迹法和羟基磷灰石(HAP)单点饱和分析法，分别测定27例单纯手术治疗(单纯手术组)及6例术前口服米非司酮每天25 mg共3个月(米非司酮组)的子宫肌瘤患者的肌瘤瘤心、瘤边缘及子宫体正常肌组织中PR mRNA和PR蛋白。结果单纯手术组瘤心和瘤边缘中PR mRNA及PR蛋白水平在卵泡期和黄体期均显著高于子宫体肌组织(P＜0.01)，呈持续高表达，而瘤心和瘤边缘间差异无显著性(P＞0.05)；米非司酮组4例术前未停药者，肌瘤及子宫体肌组织中PR mRNA和PR蛋白水平均明显降低，2例术前停药1月者，上述组织中PR mRNA与单纯手术者相似，但PR蛋白仍处于低水平。结论子宫肌瘤中PR基因呈持续高表达。米非司酮能抑制PR基因的表达，在mRNA水平上的影响是可逆的，在蛋白水平上的影响持续时间较长。

Effect of Mifepristone on the Expression of Progesterone Receptor Messenger RNA and Protein in Uterine LeiomyomataSun Mei, Zhu Guozhang, Zhou Lirong, et al.Obstetrics and Gynecology Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200011

【Abstract】ObjectiveTo determine the expression of progesterone receptor (PR) mRNA and PR protein levels in the myometrium and leiomyomata from untreated and mifepristone pretreated women with leiomyomataand to examine the mechanism of mifepristone treatment on uterine leiomyomata.MethodsExpression of PR mRNA and PR protein were determined by Northern blot and HAP of single-dose saturated analysis in myometrium and leiomyomata (center and marginal area) from 27 untreated and 6 mifepristone pretreated women with leiomyomata.ResultsPR mRNA abundance and PR protein levels in both myomatous center and marginal area were significantly greater than those in corporal myometrium (P＜0.01) in both follicular and luteal phases, but similar between myomatous center and marginal area (P＞0.05). 6 cases pretreated with mifepristone 25 mg/day for 3 months were operated, all but one patient displayed a decrease in leiomyomata volume. PR mRNA abundance in both myometruim and leiomyomata (center and marginal area) was significantly decreased in 4 patients continuing mifepristone treatment before the operation but not in the other 2 patients stopping RU486 1 month before operation. PR protein levels in these tissues showed significant decrease in all 6 cases.ConclusionThere are overexpression of PRmRNA and PR protein in leiomyomata. One of the mechanism of mifepristone action on decreasing leiomyomata volume may be related to suppression on expression of PR gene. It seems that suppression on transcription of PR gene is reversible, but on translation of PR gene may maintain in a relatively longer period.

【Key words】Mifepristone Uterine neoplasmsLeiomyomaReceptors, progesteroneGene expression

子宫肌瘤是妇科常见的良性肿瘤，在生育期妇女中发病率约为25%^［1］，是导致育龄期妇女行全子宫切除术的主要原因之一^［2］。近年来孕激素(P)及其受体(PR)对子宫肌瘤的影响受到重视。研究表明，肌瘤中PR mRNA及PR蛋白表达水平均高于正常肌组织^［3］；P可促进肌瘤细胞分裂，刺激肌瘤生长^［4，5］。抗P制剂米非司酮可使肌瘤体积显著缩小^［6］。但关于米非司酮对子宫肌瘤中PR基因表达的影响迄今未见报道。本研究旨在从子宫肌瘤组织及子宫体正常肌组织中PR mRNA及PR蛋白的表达水平，研究米非司酮治疗子宫肌瘤的作用机理。

资料和方法

一、研究对象

选自1993年12月至1995年12月间在上海医科大学妇产科医院中西医结合科就诊的33例子宫肌瘤患者，均有不同程度的月经过多、痛经及盆腔包块等临床表现。妇科检查及B超证实为子宫肌瘤，而无其它妇科肿瘤等疾病。所有患者以往月经规则，近3个月内无类固醇激素使用史，肝功能正常。分为两组：单纯手术组27例，平均年龄44.5岁(34～52岁)，18例在卵泡期、9例在黄体期行全子宫切除术，术后病理诊断证实为子宫肌瘤。米非司酮组6例，从月经周期第5天起连续口服米非司酮，每天25 mg，共3个月。所有患者服药后均停经，但无潮热、盗汗、心悸及烦燥等绝经期症状，血中雌、孕激素水平均无明显改变，一直在门诊定期随访。5例患者肌瘤明显缩小，手术原因分别为：1例停药1年后肌瘤长大，于再服米非司酮1月后手术；2例肌瘤较大，米非司酮治疗3个月后手术，其中1例为乳腺癌根治术后，1例服药前后内膜均为增生过长；5例中术前未停药者4例，1例停药1月内手术；另1例服药3个月后肌瘤未见缩小，于停药1月内手术。6例患者术前均未恢复月经。术后子宫内膜组织切片诊断，5例子宫内膜呈增生反应，1例呈分泌反应。6例患者服药前与单纯手术组比较，两组的年龄、子宫大小、子宫肌瘤大小和激素水平差异均无显著性。两组治疗前全身状况差异亦无显著性。

手术切除的新鲜肌瘤(包括肌瘤的瘤心和瘤边缘)及子宫体正常肌组织立即置液氮中冷冻，并存放于-70℃冰箱，待检。

二、方法

1.总RNA的抽提及Northern印迹法测定PRmRNA：采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法^［7］从0.5 g肌瘤组织或子宫体肌组织中抽提总RNA。每份样品取40 mg总RNA在1.2%琼脂糖/17.9%甲醛变性凝胶上电泳。每块凝胶上均用同一标准作对照。将溴乙啶(EB)加到每份样品中以检测28S和18S rRNA强度，用以判定样品RNA的含量和质量。用毛细管洗脱法将RNA转移到尼龙膜(Hybon-Nnylon，美国Amersham公司产品)上，在紫外交联机(Gs Gene Linker U-V Chamber,美国BIO-RAD公司产品)中用紫外线将RNA交联固定于尼龙膜上。用随机引物法标记人PR cDNA(2.4kb，编码区域EcoRI-HindⅢ片段)及小鼠β-actin cDNA(2.0kb)作为探针(比活为5×10⁸cpm/ng)，分别与每块膜于65℃杂交炉(Hybridisation Oven，美国Appligene公司产品)杂交过夜。洗膜后于-70℃放射自显影，用岛津CS-930双波长扫描仪(日本)进行 PR mRNA密度定量。杂交后湿润尼龙膜用洗脱缓冲液(10mmol Tris-Hcl， pH8.0，1mmol EDTA，0.1%SDS)于95℃洗涤30分钟，以除去杂交信号，用于下一次杂交。

2.组织胞浆蛋白抽提及羟基磷灰石(HAP)单点饱和分析法测定PR含量：将0.5 g上述储存的组织置冰浴中，按1∶6(W/V)于3 ml抽提缓冲液(10mmol Tris-HCl， pH7.5，1mmol二硫苏糖醇，10%甘油，10mmol钼酸钠，1mmol PMSF，0.01μg/ml Bactrasin，0.01μg/ml leupeptin)中剪碎，用组织分散器匀浆，于4℃2 500 r/min离心15分钟，上清液再经超速离心机(Centrikon T-2 080，瑞士Kontron公司产品)超速离心(105 000 r/min 4℃)1小时，上清液即为所抽提的组织胞浆蛋白液，用考马斯亮蓝-250/牛血清白蛋白法测定蛋白量。

在200 μl反应体系中，加入200μg胞浆蛋白与³H-R₅₀₂₀(86.7 Ci/mmol，美国Dupon T公司产品)。反应终浓度为15nmol/ml)反应，非特异性结合由加入100倍的非标记R₅₀₂₀(美国Dupon T公司产品)测得。样品置于4℃孵育16～18小时，加入0.3 ml 60%HAP(上海生化所申华公司)，混匀15分钟，每5分钟振荡1次以吸附结合的3^H-R₅₀₂₀-PR复合物，经滤纸负压抽滤，用5 ml洗脱缓冲液(10mmol Tris-HCl， pH8.0，10mmol磷酸二氢钠，1%吐温-80)洗涤3次，抽干，滤纸片及沉淀置5ml 0.4%PPO-popop-二甲苯闪烁液中闪烁计数。

三、统计学方法

肌瘤与肌组织的比较采用配对t检验，单纯手术组与米非司酮组的比较采用两样本均数比较的t检验。上述分析由SPSS/PC+V3.0软件和LBM PC80 486兼容机进行处理。数据以±s表示。

结果

一、单纯手术组肌瘤及子宫体肌组织PR mRNA及PR蛋白的表达水平

琼脂糖电泳显示，总RNA的28S和18S条带清晰，说明RNA质量稳定；作为内标的管家基因，β-actin mRNA(2.0 kb)条带的灰度一致，表明每一泳道40 μg总RNA的上样量稳定；PR mRNA的大小由28 S和18 S的大小及其迁移率计算而定。大批量样品分别在多张膜上杂交，每张膜均点有同一等量的标准样品，以尽量缩小批间误差。2例肌瘤患者的肌瘤瘤心、瘤边缘及子宫体肌组织中PR mRNA的Northern印迹法检测结果显示，PR mRNA的主带位于11.1 kb处(图1)。

M：子宫体肌组织C：肌瘤瘤心A：瘤边缘P：阳性对照

图1PR mRNA的Northern印迹法检测结果

PR mRNA主带密度扫描数据经膜内β-actin及膜间标准较正。单纯手术组的肌瘤瘤心及瘤边缘组织中PR mRNA表达量在卵泡期与黄体期均高于子宫体肌组织(卵泡期P＜0.01，黄体期P＜0.05)，而瘤心与瘤边缘组织间差异无显著性(P＞