【摘要】目的通过探讨雌、雄激素对人卵巢颗粒细胞凋亡的作用，阐明其调节人类卵泡闭锁的分子机制。方法应用细胞培养、选择性DNA抽提和琼脂糖凝胶电泳技术分析闭锁卵泡和发育中卵泡颗粒细胞的凋亡状况，及雌激素(1 μg/ml)、雄激素(1 μg/ml)对体外培养发育中的卵泡颗粒细胞凋亡的作用；用Northern印迹杂交技术检测经雌、雄激素刺激后发育中的卵泡颗粒细胞bcl-2基因mRNA表达的变化。结果闭锁卵泡颗粒细胞均出现凋亡，bcl-2基因mRNA表达下降，雌激素则可致相反的效应。结论卵泡闭锁的本质可能是其细胞发生凋亡；雄激素促进卵泡闭锁、雌激素对抗雄激素作用及促进卵泡发育的机理，可能与调节内源性核酸内切酶的活化和bcl-2基因表达有关。

The Effect of Sex Steroids on Human Ovarian Granulosa Cell ApoptosisWu Ji, Zhang Lizhu, Li Tan, et al.^*The Third Clinical Medical College, Beijing Medical University, Beijing 100083

【Abstract】ObjectivesTo study the molecular mechanism of human follicular atresia by exploring the effects of estrogen, androgen on human granulosa cell (GC) apoptosis. MethodsOvarian GC DNA fragments of both atretic and developing follicles before and after estrogen (1 μg/ml), androgen (1 μg/ml) treatments were analysed by agarose gel electrophoresis. The expression of bcl-2 mRNA was also determined by northern blotting in GC of developing follicle after sex steroids addition. ResultsInternucleosomal DNA cleavage occurred in granulosa cells in atretic follicles and after androgen treatment. In granulosa cells of developing follicles, estrogen treatment increased the expression of bcl-2 mRNA by 45%, while androgen treatment downregulated the expression of bcl-2 mRNAby 35%. ConclusionAndrogens increase apoptotic DNA fragmentation, and decrease the expression of bcl-2 mRNA in GC of developing follicles, while estrogens produce the opposite effect. Therefore, expression of bcl-2 may be involved in the mechanism of follicular development and atresia.

【Key words】ApoptosisAndrogensEstrogensOvary

在新生儿阶段卵巢内约有数百万个卵母细胞，但99%开始发育后即发生退行性变、卵泡闭锁。在整个生育年龄阶段只有几百个卵泡可发育成熟并排卵。早期研究显示，促性腺激素和甾体激素于青春期开始调节卵巢内卵泡发育和闭锁过程^［1］。近年研究显示，鸡、猪等动物的卵泡闭锁与细胞凋亡有关^［2，3］。然而对甾体性激素调节人类卵泡闭锁的分子机制了解甚少。本研究试图通过探讨雌、雄激素对人卵巢颗粒细胞凋亡的作用，阐明其调节人类卵泡闭锁的分子机制。

材料与方法

一、材料

标本来自本院及人民医院、北京铁路总院、海军总医院、解放军154医院妇产科1995年5月至1996年7月间收治的46例巧克力囊肿、畸胎瘤病例手术时取到的正常卵巢组织，患者年龄30～46岁。

二、方法

1.取材：卵巢组织切下后，立即保温带到实验室，用温(34℃)磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗卵巢组织，去除血块。然后在实体显微镜下将有腔窦状卵泡剪破，将卵母细胞和颗粒细胞一起冲洗到PBS中，分离卵母细胞并在倒置显微镜下观察卵母细胞的形成。每一标本获卵泡数为2～12个，闭锁卵泡数占1/3～1/8。根据如下特点及Tsafriri等^［4］的判断标准判断为闭锁卵泡：(1)卵泡液混浊；(2)卵母细胞形态不规则，与透明带间隙变宽；(3)卵母细胞固缩或细胞核已看不清。无上述特点者为发育中卵泡。

2.发育中卵泡颗粒细胞的体外培养：将发育中卵泡的颗粒细胞以10⁴个/ml密度接种于含10%小牛血清(天津生物制品研究所产品)的RPMI-1640(美国GIBCO产品)培养液中，37℃、5% CO₂恒温培养。于培养第2天细胞换液时分成4组：(1)对照组：不加任何性激素；(2)雌激素组：培养液中加雌二醇1 μg/ml (美国Sigma公司产品)；(3)雌、雄激素组：培养液中加雌二醇1 μg/ml和睾丸酮1 μg/ml(美国Sigma公司产品)；(4)雄激素组：培养液中加睾丸酮1 μg/ml。性激素作用时间为24小时或12小时。

3.选择性DNA抽提与琼脂糖凝胶电泳：参照Gong等^［5］的方法。直接将闭锁卵泡、发育中卵泡的颗粒细胞以及经不同甾体激素作用下(时间为24小时)培养的4组发育中卵泡的颗粒细胞进行选择性DNA抽提和琼脂糖凝胶电泳(试剂来自美国Sigma公司)，并根据电泳后是否呈梯状带形判断细胞是否发生DNA断裂。

4.bcl-2基因mRNA的检测：应用Northern印迹杂交技术检测4组发育中卵泡的颗粒细胞bcl-2基因mRNA表达。首先采用异硫氰酸胍一步法^［6］提取对照组以及经性激素作用12小时的各组发育中卵泡颗粒细胞总RNA，然后参照分子克隆方法^［7］进行其余步骤。试剂来自美国GIBCO、Promega及Sigma公司，α³²P标记的脱氧三磷酸胞苷(α³²P-dCTP)来自北京亚辉生物医学工程公司。bcl-2 (cDNA) (2.5 kb)来自中国医学科学院肿瘤所。

结果

一、发育中卵泡与闭锁卵泡的颗粒细胞DNA凝胶电泳结果

发育中卵泡与闭锁卵泡的颗粒细胞(细胞总数均为10⁷)DNA经琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示：闭锁卵泡的颗粒细胞DNA发生断裂，成为180～200 bp及其倍数的片段，呈梯状带形(“ladder”)，而发育中卵泡的颗粒细胞无明显的DNA梯带。

二、甾体性激素对发育中卵泡颗粒细胞的作用

将培养2天的发育中卵泡的颗粒细胞分别用雌激素、雌激素加雄激素和雄激素刺激24小时，然后进行选择性DNA抽提和琼脂糖凝胶电泳分析，显示雌激素组或雌、雄激素组的颗粒细胞DNA均无明显的梯状带形，而雄激素组颗粒细胞则出现核小体间DNA断裂，即产生明显的DNA断裂梯带(图2)。

1.发育中卵泡颗粒细胞DNA2.闭锁卵泡颗粒细胞DNA3.φ174/HaeⅢ marker (DNA标准参照物，下同)

图1闭锁卵泡与发育中卵泡的颗粒细胞DNA电泳分析

1.对照组2.雄激素组3.雌、雄激素组4.雌激素组

图2性激素作用后发育中卵泡颗粒细胞DNA细胞电泳分析

三、性激素作用后发育中卵泡颗粒细胞bcl-2基因mRNA的表达

用性激素作用发育中卵泡颗粒细胞12小时后，提抽细胞总RNA，其bcl-2基因mRNA的变化如图3所示，与对照组比较，雌激素、雌激素加雄激素作用时bcl-2基因mRNA表达分别增加45%和20%左右，而雄激素作用时则下降35%左右。

1.雌激素组2.雌、雄激素组3.对照组4.雄激素组

图3性激素作用后发育中卵泡颗粒细胞

bcl-2基因mRNA的表达

讨论

一、细胞凋亡与卵泡闭锁

细胞凋亡是在生理条件下的细胞程序化死亡。判断细胞凋亡的一个最直观指标就是染色体DNA的片段化，DNA在核小体之间被切断，成为180～200 bp及其倍数大小的一系列DNA，进行核酸电泳后可看到一个DNA梯带。细胞群体的生长是细胞增殖和细胞凋亡的动态过程。本研究发现，闭锁卵泡颗粒细胞DNA发生断裂呈梯状带形(“ladder”)，而发育中的卵泡颗粒细胞DNA无明显断裂，无“ladder”。说明，闭锁卵泡颗粒细胞绝大部分发生凋亡，而发育中卵泡颗粒细胞无明显凋亡。由此提示，细胞凋亡可能是形态学上认为卵泡闭锁的分子机制之一^［8］。

二、甾体性激素对人卵巢颗粒细胞凋亡的作用及机理

甾体性激素是重要的卵巢内卵泡闭锁调节因素。在人、羊、猪体内，闭锁卵泡液雌二醇量降低，而雄激素量增加，且这种变化一般在卵泡闭锁的形态特征出现以前即可被观察到^［9］。本研究观察到，雄激素能够使体外培养的发育中卵泡颗粒细胞出现DNA断裂，而雌激素则具有相反的作用，即同时加入雌激素和雄激素后颗粒细胞无明显DNA断裂。由此说明，雄激素能诱导或促进卵泡颗粒细胞凋亡，而雌激素则抑制其凋亡。作用机理可能是雌激素通过抑制内源性核酸内切酶的活化而抑制DNA片段化(因细胞凋亡出现DNA片段化是由于内源性核酸内切酶活化所致)，最终抑制细胞凋亡，雄激素则对抗雌激素的这种作用，以促进细胞凋亡。从基因角度，本研究结果提示雌激素对颗粒细胞的作用机理可能与上调凋亡抑制基因bcl-2 mRNA的表达有关，雄激素则可能与下