【摘要】 目的 探讨子宫内膜局部免疫细胞在妊娠中的作用。方法 采用免疫组化技术和原位杂交技术，研究20例正常孕妇的早孕蜕膜组织内淋巴细胞的分布、表型特征及穿孔素蛋白和mRNA的表达。结果 早孕蜕膜组织内T总淋巴细胞(CD₃⁺淋巴细胞)、抑制或杀伤T淋巴细胞(CD₈⁺淋巴细胞)较少，约占3%；辅助T淋巴细胞(CD₄⁺淋巴细胞)极少，甚至看不到。早孕蜕膜组织内大部分淋巴细胞为表达穿孔素的自然杀伤样细胞(CD₅₆⁺非典型淋巴细胞)，约占70%。结论 早孕蜕膜组织中淋巴细胞分布以CD₅₆⁺非典型淋巴细胞为主是其特点，其淋巴细胞的分布有利于胚胎着床、发育及维持正常妊娠。

The Role of decidua Tissue Lymphocytes in Early Pregnancy Tian xiuzhu^*,Zhang Lizhu, Wu Yan, et al. ^*The First Hospital of shanxi Medical University, Taiyuan 030001

【Abstract】 Objective To investigate the role of lymphocytes in early pregnancydecidua tissue. Methods Immunohistochemical and in situ hybridization techniques wereemployed to demonstrate the population, phenotype and mediator of lymphocytes inearly pregnancy decidua. Results In early pregnancy decidua, CD₃⁺ T lymphocytes and CD₈⁺ suppressor/cytotoxic T lymphocytes were very few. CD₄⁺ helper lymphocytes were few and CD₅₆⁺ lymphocytes (also named nK-like cell) were abundant. CD₅₆⁺ lymphocytes containing perforin protein and expressing perforin mRNA were observed.Conclusions The lymphocytes in early pregnancy decidua are specific and may play an important role in early pregnancy. They probably exert some positive influence on

embryo implantation and placental development, and maintain the balance between trophoblastic cells and decidua tissue.

【Key words】 Decidua lymphocytes Membrane glycoproteins Pregnancy trimester, first

母体免疫系统不排斥做为半同种移植物的胎儿，是一非常复杂的过程。此种免疫调节作用不仅发生于母体全身免疫系统，而且也发生在妊娠子宫局部，这种局部免疫因素的调节更直接地影响着胚胎的着床、发育，在保护胎儿存活中起着关键作用。近年来，人们对早孕蜕膜组织淋巴细胞进行了研究，并发现了其规律^［1］。但对其效应产物穿孔素的研究报道较少。本研究采用免疫组化技术与原位杂交技术，观察人早孕蜕膜组织中淋巴细胞及其效应产物穿孔素的表达，探讨其在妊娠中的作用。

资料与方法

一、研究对象

20份早孕蜕膜组织来自1995年5月在我院计划生育室行人工流产的20例正常孕妇，年龄26～30岁，身体健康，妊娠周数6～8周。将蜕膜组织取出，去除表面血迹，液氮内迅速冻存。

二、方法

1.蜕膜组织淋巴细胞的分离：采用机械分离法。将蜕膜组织漂洗、剪碎，53μm细胞筛过滤，采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，漂洗后将此细胞放入RPMI1640+10%小牛血清培养液中，37℃ 5%二氧化碳培养箱中培养过夜，回收悬浮的淋巴细胞，固定后备存。

2.早孕蜕膜组织淋巴细胞分布测定：对蜕膜组织冰冻切片及分离的淋巴细胞进行免疫组化ABC法检测。Ⅰ抗为鼠抗人CD₃、CD₄、CD₈、CD₅₆抗体(丹麦Dako公司生产)，鼠抗人穿孔素抗体由美国迈阿密大学提供；Ⅱ抗为生物化羊抗鼠IgG；Ⅲ抗为辣根酶标记的链霉卵白素(购自中山生物技术有限公司)。主要步骤均按ABC免疫组化试剂盒内说明进行。双重免疫组化法选用双ABC法，中间洗脱过程选用甘氨酸-盐酸洗脱液，0.5%焦亚硫酸还原。结果判定：光镜下观察细胞阳性信号分别为红色、棕黄色、蓝色，分别在蜕膜间质细胞膜表面和细胞浆内表达。各类阳性淋巴细胞和穿孔素阳性淋巴细胞半定量测定：每张切片随机选取5个高倍视野，计算阳性细胞占全部间质细胞的百分比。并设以磷酸缓冲液代替Ⅰ抗、Ⅱ抗、Ⅲ抗的阴性对照，阳性对照选自外周血淋巴细胞。

3.早孕蜕膜组织穿孔素mRNA表达的测定：(1)穿孔素探针制备：人穿孔素质粒PTZ19u由美国迈阿密大学提供；人穿孔素质粒DNA转化、提取、鉴定、回收，采用碱裂解法与低溶点琼脂糖凝胶DNA片段回收技术。(2)早孕蜕膜组织穿孔素mRNA表达的测定：采用原位杂交法，穿孔素cDNA探针标记采用非同位素地高辛检测试剂盒，冰冻切片8μm。①杂交前处理与预杂交：切片经4%多聚甲醛固定，0.2当量盐酸与蛋白酶K消化，0.1 mol三乙醇胺乙酰化，加入预杂交液，42℃反应4小时；②杂交：将含有1μg/ml探针的杂交液95℃变性、冰内骤冷后，加入组织上，42℃杂交16～17小时。③杂交后处理与杂交信号的检测：切片均用缓冲盐液漂洗，加入1∶500地高辛抗体4℃过夜，次日加入底物5-溴-4-氯-3吲哚磷酸(BCIP)与显色原硝基四氮唑蓝(NBT)显色液，镜下观察，阳性结果为细胞浆内可见紫蓝色mRNA颗粒，并设阴性对照，拍摄照片。

结果

一、早孕蜕膜组织淋巴细胞的分布

早孕蜕膜组织中典型的T总淋巴细胞(CD₃⁺淋巴细胞)、抑制或杀伤T淋巴细胞(CD₈⁺淋巴细胞)数量较少，约占蜕膜间质细胞的3%，辅助T淋巴细胞(CD₄⁺淋巴细胞)在早孕蜕膜组织中极少，甚至看不到。早孕蜕膜组织淋巴细胞中以自然杀伤样细胞(CD₅₆⁺非典型淋巴细胞)为主，约占间质细胞的70%。见图1～5。

二、早孕蜕膜组织穿孔素蛋白的表达

早孕蜕膜组织与从蜕膜组织分离的淋巴细胞中可见穿孔素蛋白颗粒(图6)。用双重免疫组化技术发现，无论早孕蜕膜组织或是分离出的淋巴细胞中，均可见细胞膜着色为红色的CD₅₆⁺淋巴细胞，此阳性细胞内含有蓝色的穿孔素蛋白颗粒(图7)。

三、早孕蜕膜组织穿孔素mRNA的表达

1.人穿孔素cDNA片段的制备：如图8所示。

 A：DNA Marker B：人穿孔素质粒PTZ19u，片段长度3 420 bp C：EcoRI酶切后的PTZ19u D：纯化的穿孔素cDNA探针长度560 bp图8 人穿孔素cDNA片段制备

2.早孕蜕膜组织穿孔素mRNA的表达：早孕蜕膜组织部分间质细胞中可见穿孔素mRNA的大量表达，蜕膜腺体细胞内阴性表达，间质内部分阳性细胞有群集现象，大多集聚于血管周围，血管内也可见阳性表达的细胞(图9)。

讨论

一、早孕蜕膜组织中淋巴细胞分布的意义

本研究采用免疫组化的方法观察正常孕妇早孕蜕膜组织中淋巴细胞的分布、表型特征及其表达的效应产物穿孔素，发现蜕膜组织内淋巴细胞分布有其特点，即在外周血中含量多的CD₃⁺淋巴细胞、CD₈⁺淋巴细胞，在蜕膜组织中含量较少，约占3%，CD₄⁺淋巴细胞极少，甚至看不到。CD₄⁺淋巴细胞可产生白细胞介素2(IL-2)，促进T细胞增殖，从而引起免疫应答。因蜕膜组织内CD₄⁺淋巴细胞极少，因此，在保护胚胎免受母体免疫系统排斥方面起了一定作用。另外也有学者认为，胚胎不受母体免疫系统攻击是由于其滋养层细胞不表达典型的组织相容性复合体(MHC)的结果^［2，3］。

本研究发现，早孕蜕膜组织中大部分淋巴细胞为CD₅₆⁺非典型淋巴细胞，约占间质细胞的70%。此群细胞在外周血中仅占1%～2%，而其在早孕蜕膜组织中大量存在，可能与胚胎着床、发育以及胎盘的形成有关^［4］。已有研究发现，此类细胞可产生大量的细胞因子，如多种集落刺激因子、肿瘤坏死因子、γ-干扰素、转化生长因子，这些因子在蜕膜组织内形成了一完善的细胞因子网络，对妊娠的维持起着重要的局部调节作用^［5］。

二、穿孔素在早孕蜕膜组织中的作用

穿孔素也被称为管道形成蛋白，是近年来发现的分子量为60 kDa的具有杀伤功能的蛋白质。穿孔素单体在钙离子存在下，可以结合到靶细胞膜上，形成多聚体跨膜通道，导致靶细胞死亡^［6］。穿孔素的大量表达一般仅发生在一些病理状态下，如病毒感染、移植排斥反应、自身免疫病等，在生理状态下仅在早孕蜕膜组织中大量产生，故推测其在妊娠中发挥着一定的效应。King等^［7］发现，表达穿孔素的细胞可以杀伤对其敏感的K562肿瘤细胞，而对滋养层细胞杀伤力较弱。Croy^［8］推测，早孕蜕膜组织中穿孔素的大量产生可能在子宫内膜局部发挥作用，它可直接杀伤子宫间质细胞，为滋养层细胞的侵蚀开创路径。蜕膜组织中的穿孔素阳性细胞经IL-2活化后对滋养层细胞瘤的细胞毒性高于对正常滋养层细胞，因此认为，穿孔素<