关键词： 二异丙酚；电子自旋共振；氧自由基

摘要目的：测定异丙酚在有机和无机体系中的抗氧化作用。方法：利用电子自旋共振ESR技术和自旋捕捉法，直接观察异丙酚清除超氧离子、羟基自由基·OH以及对中性粒细胞PMN呼吸爆发产生氧自由基的淬灭作用。结果：在无机体系异丙酚能比较有效地清除羟基自由基，而对超氧阴离子则需较高的浓度(＞500μmol/L)；在有机体系异丙酚在临近麻醉浓度时即能较明显地淬灭中性粒细胞呼吸爆发产生的氧自由基。结论：异丙酚能比较有效地清除有机和无机体系产生的羟基自由基，这可能是其抗氧化性的主要机制之一，Diprivan的赋形剂内脂成份可影响其抗氧化性能

Research on the potential antioxidation of propofol with ESR

Cao Yunfei，Yu Weifeng，Wu mengchao，et al．Department of Anesthesiology，Eastern Hepatobiliary Surgical hospital，Shanghai 200433

Abstract objective： To measure the potential antioxidation of propofol in biological and nonbiological system．Method：Directly observing the scavenging effects of propofol on superoxide anion，hydroxyl radical and oxygen free radical produced by the respiratory burst of polymorphonuclear neutrophils（PMN） by electron spin resonance and spin trapping．Result： Propofol effectively scavenged hydroxyl radical in nonbiological system，but for superoxide anion，high concentration（＞500μmol/L） of propofol was needed；In biological system near the range of anaesthetic concentration，propofol effectively scavenged oxygen free radical produced by respiratory burst of PMN．Conclusion：Propofol scavenging hydroxyl radical generated in biological and nonbiological system，may be one of the main mechanisms of its antioxidation，the intralipid component of diprivan may affect its antioxidation．

Key words Propofol Electron spin resonance Oxygen free radical

异丙酚(propofol)，化学名2、6-二异丙基苯酚，是一种新型的静脉麻醉药，已广泛应用于临床麻醉和镇静治疗。近来发现，除了其麻醉镇静为主的生物学作用外，异丙酚尚具有较强的抗氧化作用^〔1〕。但目前对异丙酚的抗氧化性能及其作用机制还存在着较多分歧。本文利用电子自旋共振ESR技术和自旋捕捉法，直接观察异丙酚对氧自由基的清除作用，以进一步阐明异丙酚的抗氧化性能及其作用原理。

材料和方法

主要试剂与仪器自旋捕捉剂DMPO（5，5-dimethyl-l-pyrroline-l-oxide，Sigma公司产品)用活性炭避光提纯后，在ESR波谱仪检测无杂质信号，置-20℃避光保存；刺激剂PMA（phorbol myristate acetate，Sigma 公司产品)用少量丙酮溶解，－20℃保存。Diprivan和分析纯异丙酚均为ZENECALimited公司产品，用少量DMSO(作超氧阴离子的ESR测试)或丙酮(作羟基自由基以及对PMN呼吸爆发产生氧自由基的ESR测试)溶解后，稀释至所需的浓度。二甲基亚砜DMSO(CR级，上海硫酸厂出品)，经重蒸后，用0.4nm分子筛除水。二乙三胺五乙酸(DETAPAC)及其他试剂均为国产分析纯。仪器：ER200D-SRC电子自旋共振仪，ER41111VT变温装置，均为西德Brucker公司产品。

异丙酚清除超氧阴离子()的ESR测定^〔2〕：将含饱和空气的二甲基亚砜(DMSO）溶液分别与不同浓度、不同溶剂的异丙酚配制液混匀，然后加入NaOH，于室温下一经混合立即计时，反应45分钟后定量吸取反应液置于直径3mm样品管内，在低温(－130℃)时用电子自旋共振仪测定体系中超氧阴离子的信号强度均值。观察异丙酚对超氧阴离子的清除效果。测试条件：微波频率为9.65GH_Z，微波功率为20mW，X波段，高频调制频率为100KH_Z，调制幅度为0.5Mt。

异丙酚清除羟自由基·OH的ESR测定^〔3〕：加入不同浓度、不同溶剂的异丙酚配制液、0.4mol/L自旋捕捉剂DMPO、0.4mmol/LFeSO₄-（NH₄）₂SO₄和0.4mol/L的H₂O₂各10μl，混合均匀后立即封入石英毛细管中，测2分、6分、10分、14分钟时DMPO-OH的ESR波谱。测试条件：功率20mW，X波段，高频调制100KHz，调制幅度0.79G，时间常数0.1s。

人中性粒细胞hPMN按文献用PPP(贫血小板血浆)法进行分离提纯^〔4〕：取健康成人空腹新鲜静脉血(肝素抗凝)，离心275g×15分钟后，吸取上清液制备PPP(贫血小板血浆)，沉淀用Dextran-500沉降红细胞后，吸取富白细胞上清用Percoll液分离提纯人中性粒细胞，并用PBS稀释到5×10⁷个/ml悬液备用。分离的中性粒细胞纯度和活性检验均大于95%。

异丙酚对中性粒细胞PMN呼吸爆发产生氧自由基的影响^〔3，5〕：取15μlPMN悬液(5×10⁷个/ml)，10μlDETAPAC0.8mmol/L，5μl不同浓度、不同溶剂的异丙酚配制液，10μlPMA100mg/ml混合均匀后，37℃水浴温育2分，加10μlDMPO，混合均匀后立即封入石英毛细管中，上机检测。测试条件：功率20mW，X波段，高频调制100KHz，调制幅度1G，时间常数0.128s。

结果

实验表明：含5mmol/LNaOH和1%(V/V)水的DMSO碱性溶液于室温下反应30～60分钟为产生超氧阴离子()的最佳模型体系^〔2〕。低温(－130℃)时，被测样品呈固定状态，在ESR波谱仪上得到g_／／=2.1015,g_⊥=2.0078(g为波幅参数)的各向异性谱，该信号是存在的特征。O₂直接参与了产生自由基的反应，在DMSO溶液中发生单电子转移反应产生。在此反应体系中，Diprivan在浓度大于500μmol/L时对超氧阴离子有明显的清除能力(P＜0.01)，而小于此浓度时反而可轻微地促进超氧阴离子的产生；分析纯异丙酚则在浓度大于1mmol/L时才有清除超氧阴离子的作用(P＜0.01)，Diprivan和分析纯异丙酚在浓度达到10mmol/L时均可比较完全地(＞90%)清除反应体系中产生的超氧阴离子(见图1)。

图1异丙酚对超氧阴离子()的清除作用

注：——分析纯异丙酚——Diprivan

1～8组分别对应于浓度为0、62.5、125、250、500μmol/L和1、5、10mmol/L的异丙酚

在此反应体系中，羟基自由基的产生在前15分钟内随时间逐渐递增，Diprivan和分析纯异丙酚对这个时程产生的羟基自由基均有一定的清除作用，且呈浓度依赖性。50μmol/L以上的Diprivan对羟基自由基有明显的清除作用(P＜0.05)，见图2；而分析纯异丙酚在25μmol/L时就比较有效(P＜0.05)，如图3所示。但即使在浓度高达5mmol/L时，Diprivan和分析纯异丙酚亦未能完全淬灭羟基自由基(信号幅度约减少一半左右)。当将H₂O₂的浓度提高至1.6mol/L时，两种异丙酚的各个浓度配制液均未表现出抗氧化性能(实验资料未在本文显示)，故异丙酚对羟基自由基的清除作用也十分有限。

图2Diprivan对羟基自由基的清除作用

注：a,b,c,d,e线分别对应于浓度为0,25,50,500,5000μmol/L的Diprivan

图3分析纯异丙酚对羟基自由基的清除作用

注：a,b,c,d,e线分别对应于浓度为0,25,50,500,500μmol/L的分析纯异丙酚

中性粒细胞在静息状态下(未加PMA刺激剂)，ESR波谱几乎成一直线，表明中性粒细胞的NADPPH氧化酶处于未活化状态，细胞内无活性氧产生；加入PMA后，激活中性粒细胞而发生呼吸爆发，ESR上出现活性氧的波谱(实为超氧阴离子和羟基自由基·OH混合波谱)。除25μmol/L的Diprivan外，其他各浓度组的异丙酚对中性粒细胞呼吸爆发所释放的氧自由基均有一定的消除作用(P＜0.05)，如图4所示，但两者的清除能力没有明显的区别。值得注意的是，两者在浓度高达250μmol/L时，其抑制中性粒细胞呼吸爆发产生氧自由基的能力也十分有限。

图4异丙酚对PMN呼吸爆发产生自由基的