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摘要 目的：观察大鼠胚胎海马神经细胞及星状胶质细胞在不同浓度高晶体-高胶体渗透压混合液中容积的变化。方法：原代培养海马神经细胞及星状胶质细胞，暴露于不同浓度混合液后测其容积。结果：15分钟后海马神经细胞容积与对照值相比明显下降。第7天基本恢复至对照组水平。星状胶质细胞在15分钟后，与对照组相比无明显改变。60分钟至1天后明显萎缩。第7天基本恢复至对照组水平。结论：海马神经细胞在暴露于高晶体-高胶体渗透压混合液后未显示出明显的调节性容积增加，而星状胶质细胞表现出明显的细胞容积调节功能。第7天两种细胞均能恢复原来的水平。
The effect of hypertonic-hyperoncotic solution on cell volume of cultured hippocampal neurones and astrocytes in vitro Yuan Shiying，Zeng Bangxiong．Department of Anesthesiology，Union Hospital， Tongji Medical University，Wuhan 430022
Abstract Objective：Changes of cell volumes of hippocampal neurones and astrocytes were observed after exposition to different hypertonic-hyperoncotic solutions．Method：Hippocampal neurones and astrocytes of rat embryo were primarily cultured and then exposed to 0．05％，0．1％ and 0．25％NaCl＋hydroxyethyl starch for 15 minutes，the cell volume was determined by using the intracellular water measure technique after exposition to different solutions．Result：The cell volume of hippocampal neurones decreased significantly after exposition to hypertonic-hyperoncotic solution for 15 minutes．After 7 days，their volumes were restored to the value in control group （P＞0.05）．The cell volume of astrocytes was not significantly changed after exposition to hypertonic-hyperoncotic solution for 15 minutes．After 60 minutes all astrocytes shrunk significantly until 1 day later．7 days later，their volumes restored to the value in control group．Conclusion：The hippocampal neurones have not the autoregulative ability of the cellular volume，but astrocytes have after exposition to hypertonic-hyperoncotic solution for 15 min；the volume of both cells 7 days later can restore to the previous value．
Key words Hippocampus neurone Astrocyts Cell volume Hypertonic-hyperoncotic solution
对于多发性创伤及颅脑损伤伴失血性休克病人的紧急治疗，传统上习惯于用3～4倍失血量的等渗晶体溶液。如此大量液体在短时间内快速输入很困难，且易因为血浆渗透压的降低而导致脑水肿并伴有颅内压的升高。近年来，小容量高晶体-高胶体渗透压混合液(HHS，如7.5%NaCl+10%羟乙基淀粉)因能够快速恢复循环血容量、改善器官灌注和微循环、降低颅内压以及减轻脑水肿而得到重视和进一步的研究〔1～3〕。HHS对心脏及微循环的血流动力学及代谢的影响研究较多，但有关脑细胞在高晶体-高胶体渗透压环境中的反应，尚少有研究。本实验选择原代培养的大白鼠胚胎海马神经细胞和星状胶质细胞为研究对象，观察细胞容积在高晶体-高胶体渗透压环境中的变化。
材料与方法
细胞培养将妊娠18～20天的大白鼠用乙醚处死。在细胞培养工作台下剖腹取出胚胎，断头，剪开软颅骨，取出脑组织，在显微镜下仔细分离脑半球，弃除软脑膜，分离出海马。取海马以及海马区域沿皮质方向的组织，分别用于培养海马神经细胞和星状胶质细胞。所取组织首先在37℃的Trypsin中浸泡15分钟，然后用Hank′s缓冲液洗涤3次，每次5分钟。将处理后的组织置于装有Hank′s缓冲液的试管中，用吸管用力来回吸挤数次，直到无明显肉眼可见的组织块。所得的细胞悬浊液加入35mm的细胞培养皿中，每培养皿约500 000～800 000细胞。
海马神经细胞种植于培养皿的底部。3～4天后弃掉培养液，换上至少四天前已加入星状胶质细胞培养皿中的无血清的N２基础培养液，每3～4天更换培养液1次。星状胶质细胞用含马血清的基础培养基(MEM-HS)培养，每周更换1次。所有细胞培养于37℃，5%CO2培养箱中。
高晶体-高胶体渗透压环境的模拟 用不同量的7.5%NaCl和10%羟乙基淀粉与新鲜细胞培养液混合，使混合液中的NaCl，羟乙基淀粉的浓度分别为0.05%、0.1%和0.25%。由于细胞培养液为等渗溶液，上述0.05%、0.1%以及0.25%的NaCl+羟乙基淀粉混合液的晶体渗透压分别为312.22、321.54和349.50mosm/L，与临床和实验室研究中静脉注入7.5%NaCl+10%羟乙基淀粉末期、5分钟及15分钟时的血浆渗透压相一致〔3〕。
10～12天的海马神经细胞和2～3周的星状胶质细胞用于实验。吸弃细胞培养液，换入等量的上述各混合液，置入培养箱中。15分钟后吸弃混合液，用Hank′s缓冲液洗涤细胞2次。再换入新鲜细胞培养液，重新置回培养箱。分别于细胞暴露于混合液15分钟、60分钟、1天和7天后，测试细胞的容积。
细胞容积的测量方法 细胞容积采用细胞内水分含量的测定方法〔4〕。选择［14C］标记的3-O-Methyl-D-葡萄糖作为细胞内标记物。在上述不同的实验时间吸弃细胞培养液，用2ml 37℃的无菌磷酸缓冲液洗涤2次，加入1ml 4℃的含［14C］3-O-Methyl-D-葡萄糖的磷酸缓冲液(13.5μCi/67.5μl)于培养皿中，置于培养箱中20分钟。然后用1ml 4℃的Phloretin溶液洗涤3次，并用0.3ml 0.2mol/L的NaOH溶解和0.3ml 0.2mol/L的HCl中和。用塑料刮片刮离培养皿底部的细胞。将0.5ml的细胞溶液在液体闪烁计数仪上测其放射活性。剩余的细胞溶液用Pierce法测量其蛋白质含量。细胞容积用μl／100μg蛋白质表示。
统计学方法 所得结果以与对照组细胞容积(作为100)相比所得的平均相对细胞容积±标准差表示。实验组和对照组细胞容积的比较采用非参数统计方法的两组数据秩和检验法(Mann-Whithey法)。P＜0.05表示有显著差异。
结果
细胞容积在一周内的变化如图1～6所示。每组样本例数为4～6培养皿。对照组细胞仅置于等渗培养液中。海马神经细胞置于0.05%，0.1%和0.25%NaCl+羟乙基淀粉混合液后15分钟，其细胞容积分别明显下降28.8%、39.5%和51.1%(P＜0.05)。60分钟后所有细胞明显肿胀，分别比各自同一时间的对照组细胞容积增加165.1%、169.3%和178.9%(P＜0.05)。1天后细胞容积稍有下降，但仍大于对照组细胞容积(P＜0.05)。至第7天各组细胞容积方基本恢复至对照组水平(P＞0.05)。
星状胶质细胞置于0.05%、0.1%和0.25%NaCl混合液后15分钟，其细胞容积与对照组细胞相比无明显改变。60分钟后所有细胞明显萎缩，分别比各自同一时间的对照组细胞容积减少57.15%、64.82%和79.05%(P＜0.05)，直至1天后。第7天各组细胞容积重新增加，基本恢复至对照组细胞容积水平(P＞0.05)。
讨论
当细胞置于高渗液时，细胞膜内外形成一个内低外高的渗透压梯度。胞内水分流出到胞外，细胞容积缩小。随后通过不同的机制，细胞内渗透质浓度增加，胞外水分重新内流，细胞容积增大，基本恢复原来的容积，即“调节性容积增加”(Regulatory Volume Increase，RVI)。相反，当细胞置于低渗溶液时，其容积首先增加，随后又减少，即“调节性容积减少”(Regulatory Volume Decrease，RVD)〔5〕。RVI和RVD则是通过细胞内电解质的累积或丢失所完成〔6～13〕。RVI时细胞内电解质(主要是NaCl)的累积借助于离子的容积激活运输系统进行。神经细胞的离子运输系统主要为Na＋／K＋／2Cl－共运，其它还有Na＋／Cl－共运、Na＋／H＋、K＋／H＋交换及其有关的Cl－／HCO－３交换系统〔10～11〕。上述离子运输系统可由细胞萎缩所激活，并受蛋白激酶和磷酸激酶的影响〔12〕。RVD时，神经细胞电解质(主要是KCl)的丢失主要通过细胞容积敏感性K＋和Cl－通道〔13〕。
Passantes等〔6〕观察到，神经细胞在高渗溶液(440mOsm/L）中1～2分钟内萎缩到原始容积的70%，随后未观察到RVI的出现。Babila等〔7〕发现神经末梢在高渗溶液中首先萎缩18%，5～10分钟内又恢复到原始容积的92.4%，认为有RVI的出现。有关星状胶质细胞在非等渗溶液中容积的变化及调节已多有报道〔8～11〕。在高渗环境中，胶质细胞首先在1～2分钟内萎缩，随后在5～10分钟内完成RVI〔8～9〕。
本实验中，海马神经细胞暴露于高晶体-高胶体渗透压混合液15分钟后，其容积萎缩28.8%～51.1%，并未表现出明显的细胞容积调节功能。当细胞15分钟后从高晶体-高胶体渗透压混合液中取出，重新置于等渗培养基时，由于在高晶体-高胶体渗透压混合液中15分钟的暴露，胞内已趋向于高渗状态，等渗的培养基相对于细胞为相对低渗。此时细胞外水分由于内高外低的渗透压梯度而流向胞内。其容积应
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