摘要目的：测定异丙酚对中性粒细胞（PMN）激活后活性氧生成以及细胞内游离Ca^2＋浓度（［Ca^2＋］_i）的影响，探讨异丙酚影响PMN呼吸爆发的内在机制。方法：利用电子自旋共振（ESR）技术和自旋捕捉法，观察异丙酚对PMN呼吸爆发产生氧自由基（ROS）的抑制作用；同时采用钙荧光指示剂（Fura-2／AM)负载离体PMN并行双波长模式测定不同浓度异丙酚对静息和激活状态下PMN细胞内［Ca^2＋］_i的影响。结果：高浓度（75μM）异丙酚可使静息状态下PMN细胞内［Ca^2＋］_i升高；在有钙基质中，异丙酚对趋化三肽(fMLP)诱发的PMN胞内［Ca^2＋］_i的升高有明显的降调作用，而在无钙基质中则不明显。在无钙基质中，高浓度（≥50μM）的异丙酚对fMLP诱发PMN呼吸爆发产生ROS有明显的抑制作用；而存在胞外钙浓度时，25μM异丙酚的抑制程度更为明显。结论：异丙酚可通过作用于胞外钙内流和胞内储存钙释放影响静息及激活状态下PMN胞内［Ca^2＋］_i；异丙酚在有钙基质中对PMN呼吸爆发产生ROS的抑制作用更为明显，提示异丙酚影响PMN胞内［Ca^2＋］_i，特别是对胞外钙内流的抑制作用，可能是其抑制PMN呼吸爆发的内在机制之一。

Effects of Propofol on the Production of Active Oxygen Species

and Concentration of Intracellular Ca^2＋ in Neutrophils

Cao Yunfei，Yu Weifeng，Xia Ling，et al

Eastern Hepatobiliary Surgical Hospital，Shanghai 200438

AbstractObjective: The effects of propofol on the production of active oxygen species and intracellular Ca^2＋（［Ca^2＋］_i ） in polymorphonuclear neutrophils（PMN） were studied to elucidate their relationship and the mechanism．Methods：Directly observing the effects of propofol on the production of active oxygen species of PMN with electron spin resonance and spin trapping was carried out and the effect of propofol on ［Ca^2＋］_i in activated or inactiated PMN was also measured with double-wavelength mode using fluorescent intracellular probe fura-2．Results：High concentration（75μM）of propofol could increase ［Ca^2＋］_i in inactivated PMN．In activated PMN，under ［Ca^2＋］_o-containing condition，propofol down-regulated ［Ca^2＋］_i in PMN activated by fMLP，but it was not seen under ［Ca^2＋］_o-depleted condition．Under ［Ca^2＋］_o-depleted condition，propofol（≥50μM） inhibited the production of active oxygen species in activated PMN and under ［Ca^2＋］_o-containing condition，only 25μM of propofol was needed and its inhibition was more significant．Conclusion：Propofol can regulate ［Ca^2＋］_i in activated or inactivated PMN by affecting both Ca^2＋-influx and releasing from intracellular storage sites．Under ［Ca^2＋］_o-containing condition，propofol is more effective in inhibiting the respiratory burst of PMN due to the effects of propofol on ［Ca^2＋］_i，especially the inhibition of Ca^2＋-influx．

Key wordsPropofolPolymorphonuclear neutrophils（PMN）Active oxygen speciesCa^2＋

近来发现，静脉麻醉药异丙酚除有麻醉镇静为主的生物学作用外，尚具有较强的抗氧化作用，能有效防治各种氧化应激性损伤，其作用机制除了直接清除ROS、抑制脂质过氧化反应外，还可能包括对PMN的极化、趋化性、吞噬功能以及呼吸爆发的影响^［1，2］。鉴于中性粒细胞在组织细胞炎症损伤中的重要作用，本文试图通过测定异丙酚对PMN激活后活性氧生成以及细胞内重要的第二信使（［Ca^2＋］_i）的影响，探讨异丙酚在PMN呼吸爆发过程中的作用及其可能的机制。

材料与方法

主要试剂和仪器自旋捕捉剂（5，5-dimethyl-1-pyrroline-1-oxide，DMPO， Sigma公司）用活性碳避光提纯后，在ESR波谱仪检测无杂质信号，置－20℃避光保存。钙荧光指示剂Fura-2／AM和趋化三肽fMLP（N-formyl-Met-Leu-Phe，）均购自Sigma公司，用二甲基亚砜(DMSO)稀释；Percoll分离液和Dextran T-500购自华美生物有限公司；异丙酚（Propofol，ZENECA公司），其余试剂均为国产分析纯。所用仪器：ER200D-SRC电子自旋共振仪，ER41111VT变温装置，均为西德Brucker公司产品；双波长荧光分光光度计（Hitachi 850-型）。

PMN的分离提纯按文献用贫血小板血浆(PPP)法进行分离提纯^［3］，分离的PMN纯度和活力检验均大于95％。

PMN细胞内［Ca^2＋］_i测定^［5］将分离的PMN（1×10⁷个／ml）悬浮于HEPES液（NaCl 124mM，KCl 4mM，N₂HPO₄ 0.64mM，KH₂PO₄ 0.66mM，NaHCO₃ 15.2mM，dextrose 5.56mM和HEPES 10mM，pH7.4），用Fura-2／AM 5μM负载45分钟后，清洗3遍，重悬于HEPES buffer A液（含0.05％的BSA和1mM CaCl₂或1mM EDTA），加入不同浓度的异丙酚后，37℃温育5分钟，加入或不加fMLP 0.1μM后立即测定。测钙时，温度维持在25℃左右。

细胞内［Ca^2＋］_i的计算测定时选择激发波长340nm和380nm，发射波长510nm，狭缝均为6nm。胞内［Ca^2＋］_i按公式计算^［5］：［Ca^2＋］_i＝kd（Fo／Fs）［（R-Rmin）／（Rmax-R）］，其中R为实验观察到的荧光比值（F 340nm／F 380nm）；Kd为Fura-2／AM的解离常数，Rmax为加入Triton-100后胞内Fura-2完全与钙结合时的荧光比值；Rmin为EGTA作用后Fura-2完全未结合钙时的荧光比值；Fo／Fs分别代表无［Ca^2＋］_i和［Ca^2＋］_i饱和状态下380nm处的荧光强度。

异丙酚对PMN呼吸爆发产生活性氧的影响^［4］取15μl PMN悬液（5×10⁷个／ml）、10μl DETAPAC（0.8mM）、5μl不同浓度的异丙酚配制液，加入0.1μM的fMLP混合均匀后，37℃水浴温育2分钟，加10μl DMPO，混匀后立即封入石英毛细管中，上机检测。每一样品重复2次，取平均值。测试条件：功率20mW，X波段，高频调制100kHz，调制幅度1G，时间常数0.128秒。

统计分析除ESR值以平均值表示外，其余数据均以均数±标准差（±s）表示，成组资料t检验比较差异的显著性，P＜0.05为差异显著。

结果

异丙酚对静息状态下PMN胞内［Ca^2＋］_i的影响利用钙荧光指示剂Fura-2负载、双波长模式测定不同浓度异丙酚对静息状态下PMN胞内［Ca^2＋］_i的影响：在有钙基质（［Ca^2＋］_o＝1mM）中，对照组PMN（异丙酚浓度为0μM）的［Ca^2＋］_i为172.17±24.51nM；而在无钙基质（EDTA＝1mM）中，PMN的［Ca^2＋］_i为132.63±20.68nM。低浓度的异丙酚对静息状态下PMN胞内［Ca^2＋］_i无明显影响，而高浓度（75μM）的异丙酚在有钙或无钙基质中均可使静息状态下PMN细胞内［Ca^2＋］_i升高，但升高幅度似乎无明显差异，提示异丙酚可能主要通过促进静息状态下PMN胞内储存钙释放而使胞内［Ca^2＋］_i增加（图1）。

与同组对照组比较，^*P＜0.05

1异丙酚对静息状态下PMN胞内［Ca^2＋］_i的影响

异丙酚对激活状态下PMN胞内［Ca^2＋］_i的影响在有钙或无钙基质中，加入刺激剂fMLP后，PMN胞内［Ca^2＋］_i迅速升高，然后在10分钟内较快地下降。在有钙基质中，胞内［Ca^2＋］_i可升达613.66±61.36nm；而在无钙基质中，胞内［Ca^2＋］_i的升高幅度较小，仅达272.90±24.58nm。在有钙基质中，异丙酚对fMLP刺激引起的PMN胞内［Ca²⁺］_i升高有明显的降调作用，使其上升幅度降低，且呈浓度依赖性；而在无钙基质中这种降调作用不明显（图2）。

与同组对照