摘要目的：观察BALB/c小鼠在感染柯萨奇病毒后辅助T淋巴(Th)细胞——Th₁、Th₂细胞的动态变化以及抗柯注射液(RSF)的干预治疗对其影响。方法：将156只BALB/c小鼠分别制备成急性心肌炎、慢性心肌炎模型，各模型随机分为正常组、病毒对照组和RSF治疗组，用ELISA法检测各组小鼠Th₁、Th₂类细胞因子。结果：在急性心肌炎模型中，病毒对照组在感染后第3天Th₁达到高峰，后逐渐下降，到第12天仍高于正常，而Th₂基本于正常范围；RSF治疗组除第3天外，Th₁均下降，Th₂则表现为有明显的触发效应。慢性心肌炎模型中，各组Th₁与Th₂类细胞因子均增高。结论：在急、慢性心肌炎中，Th₁类细胞在病程中起着主导地位，Th₂类细胞则有利于疾病的改善。RSFA对coxB_3m心肌炎有显著的治疗作用，其作用机制可能是通过对Th亚群的调节来实现——即抑制Th₁细胞，增高Th₂细胞的表达来进行免疫调节。

Analysis of Th₁/Th₂ cells and the immunoregulatory effects

of RSF on mice infected by coxB_3m virus

CHEN Shu-xia¹XU Xin-hui¹ZHANG Dong-qing²

(¹Department of Cardiology,Renji Hospital Shanghai

Second Medical University,Shanghai 200001;

²Department of Immunology,Shanghai Second Medical University)

AbstractObjective:Study about the regulatory mechanism of the characteristic cytokine products of Th₁ and Th₂ cells and the expressions of Th₁,Th₂ cell intervened by Radix sophora flavescens (RSF).Method:To prepare the acute and chronic myocarditis of the murine model (156 cases).They were divided into 3 groups at random,such as CVB_3m infectious group,RSF therapeutic group and control group.The characteristic cytokines (IL-2 and IL-10) of the subsets were detected by ELISA kits (pharmingen co).Result:Th₁-like cytokine IL-2 was mostly expressed in the acute myocarditis,it was elevated maximal on day 3,and subsequently decreased,still higher than normal on day 12.The Th₂-like cytokine IL-10 was in normal range all along.In the chronic myocarditis model,the expression of cytokines was enhanced in both Th₁ and Th₂-like cells.Conclusion:The immunophysiologic responses in acute and chronic myocarditis be mainly induced by Th₁ cells,and Th₂ cells help inhibit inflammation,RSF has therapeutic roles in CoxB_3m myocarditis by regulating T help cells subsets level it facilated in inhibiting Th₁ cells and enhancing the expressions of Th₂ cells.

Key wordsCoxsackie B virusesT-Lymphocytes,helper-inducerRadix sophora flavescensViral myocarditis

1986年，Mosmann等^〔1〕首先观察到小鼠CD⁺₄T辅助(Th)细胞具有两种功能不同的亚群，即Th₁和Th₂；后来大量研究证实在人类也存在着这两类细胞。目前认为，免疫系统针对不同类型的感染能引起不同的免疫效应，而特定的免疫应答及其效应主要由Th亚群来调节。病毒性心肌炎(VM)是临床常见疾病，至今缺乏有效治疗措施。为揭示其发病机制，更好的控制该病及逆转疾病转归提供理论依据，本文对BALB/c小鼠VM模型的Th亚群调节情况进行研究。

1材料与方法

1.1材料

病毒：嗜心肌柯萨奇病毒（coxB_3m）由上海第二医科大学微生物教研室提供。病毒原液－80℃保存。动物：BALB/c纯种雄性小鼠，8周龄，体重18～20g。构自中英合资上海西普尔-必凯实验动物有限公司。抗柯注射液(RSF)：由上海第二医科大学附属仁济医院提供。

1.2动物模型的制备

急性心肌炎BALB/c小鼠100只随机分为3组：正常组：10只，腹腔注射生理盐水0.1 ml，2次/d；病毒对照组：45只，腹腔注射10^-6TCID₅₀/ml CVB₃稀释液0.1 ml；RSF治疗组：45只，腹腔注射病毒液后（量同病毒对照组），再以RSF稀释液（20 mg·kg^-1.d^-1）腹腔注射，0.1 ml/次，2次/d，共用药12 d。上述小鼠分别于第3、5、8、12天，随机取6只处死。

慢性心肌炎BALB/c小鼠56只，随机分为两组：病毒组：50只，一次腹腔注射0.1 ml10^-8TCID₅₀的coxB_3m病毒；正常组6只，腹腔注射0.1 ml生理盐水。病毒组在接种后每2周分别于腹腔注射0.05 ml 10^-8TCID₅₀的coxB_3m病毒，共4次；以后每4周腹腔注射0.1 ml10^-8TCID₅₀的coxB_3m病毒，亦为4次。分别于感染后第30天、第60天、第90天、第180天随机取部分小鼠处死。其中取感染后180 d小鼠12只，随机分为2组，即病毒对照组及RSF治疗组。RSF治疗组用RSF稀释液0.1 ml(以20 mg·kg^-1.d^-1剂量)，分2次/d腹腔注射，共治疗2周；病毒对照组每天以生理盐水0.1 ml腹腔注射，2次/d，亦为2周。

组织病理检查：取心脏用10％甲醛固定，石蜡切片，H-E及V-G染色。倒置显微镜（Olympus产品）下观察结果。炎症浸润灶1～5个/切面为＋，6～10个/切面为++，＞10个/切面为+++。坏死灶单个细胞坏死为主为＋，条索、小片状坏死为++，大片状坏死为+++。

1.3小鼠脾细胞诱导上清液的制备

无菌取脾，置适量无菌Hanks液的小平皿中。

将脾脏在不锈钢筛网上轻轻摩擦，制成单个细胞悬液，移入带盖的无菌试管中，用Hanks液洗3次，每次离心(1 000r/min)10 min。

每试管加入2～3 ml淋巴细胞分离液(1.088比重)，将脾单个核细胞悬液3 ml轻轻铺于分离液上面，离心(2 000r/min)20 min。吸出淋巴细胞层，用Hanks洗3次，每次离心(1 000r/min)10 min。在显微镜下计数细胞，用10％FCS1640（Gibco公司产品）培养液调整细胞数为2×10⁶/ml。

将2×10⁶/ml细胞浓度的单个核细胞加入96孔培养板（Costar产品）上，每孔100 μl；同时加入conA（Doko公司产品）为10 μg/孔。

将培养板置于37℃，5％二氧化碳培养箱（Heraeus产品）中孵育72 h，收集细胞悬液，离心(1 000 r/min)5 min，分别收集上清液与细胞待测。

1.4细胞因子测定（ELISA法）

标准品及标本孵育：加50 μl标准品及标本至试剂盒中所提供的96孔板（IL-2及IL-10试剂盒由Pharmingen公司提供），用封条封闭，于20～25℃下孵育3 h后洗3次。生物素标记抗体试剂孵育：加50 μl试剂至每孔，封闭后在20～25℃下孵育1 h后洗3次。Sterptaridin-HRP溶液孵育：加100 μl溶液至每孔，封闭后20～25℃下孵育30 min后洗3次。底物孵育及终止阶段：加100 μl底物至每孔，在暗室室温下酶色反应30 min后，每孔加100 μl终止液以终止反应。读取吸光度：在终止反应后30 min内于酶标免疫检测仪（Bio-Tek产品）450～550 nm下读数。拟合标准曲线，根据标准曲线方程计算标本含量。

1.5统计学处理

测定值以±s表示，采用t检验，率的比较采用χ²检验。以P＜0.05为有显著性差异。

2结果

2.1发病情况

急性组小鼠感染后第3天出现症状，表现为松毛、食欲减退、活动减少、精神萎靡、体重减轻；第5天开始死亡，死亡高峰期为第5天及第9天。慢性组小鼠感染后15 d左右出现症状，第20天开始死亡，以30～40 d为死亡高峰期。

2.2病理检查

急性心肌炎小鼠在感染后第3天时心肌尚未见病变，第5天心肌内有炎症浸润，第8天及第12天病变极为严重，心肌层大量炎症浸润且呈片状坏死。RSF治疗组能明显减轻病变程度。慢性心肌炎小鼠的心肌层有成片的坏死后纤维化，间质内及室壁近心内膜处广泛胶原纤维形成，未见明显炎症细胞浸润。

2.3Th₁/Th₂类细胞因子测定

在急性心肌炎模型中，病毒对照组中以Th₁类细胞因子——IL-2的表达为主，在感染后第3天即达到高峰，后逐下降，到第12天仍高于正常，而Th