摘要目的:了解磷脂酶C（PLC）和Gq蛋白亚单位(G_aq)与原发性高血压即高血压病的相关性。

方法:分别以Gq蛋白α亚单位(G_αq)多克隆抗体及PLC-β₁和PLC-γ₁单克隆抗体为探针，用免疫印迹（Immunoblot）方法测定人动脉平滑肌层中G_αq、PLC-β₁、PLC-γ₁的相对含量。

结果:在人类动脉血管平滑肌层中未检测到PLC-β₁，但存在G_αq和PLC-γ₁。原发性高血压病人组（n=9）和对照组（n=15）相比较，G_αq和PLC-γ₁均无显著性差异。

结论:在原发性高血压病人的发病过程中并无证明存在有G_αq和磷脂酶C信号途径的异常。

中图分类号：R544.1;R543.5;Q55文献标识码：A

文章编号：1006-2866(2000)11-0312-03

A Study on the Relationship Between Phospholipase C and Essential Hypertension

Liu ZhongHuang YuanweiHu Shenjiang

(Cardiologic Department, First Affiliated Hospital, Zhejiang Medical College of Zhejiang University, 310003 Hangzhou)

AbstractAim: to know the relationship between phospholipase C(PLC) and essential hypertension.

Method:To examine the relative content of G_αq、PLC-β₁、PLC-γ₁in arterial smooth muscle tissue using G_αq polyclonal antibody and PLC-β₁、PLC-γ₁ monoclonal antibodies as probes and immunoblot hybridization.

Result:PLC-β₁ was not detected in human's arteries, but PLC-γ₁ was found. As compared with controls(n=15), protein content of G_αq or PLC-γ₁ in arteries from hypertensive patients(n=9) had no significant change.

Conclusion:May be it is because of the long administration of antihypertensive drugs in our cases, or the abnormality of PLC-δ, whose mechanism of regulation is not clear and which is robustly expressed in arteries, or no role played by G_αq and PLC in the pathogenesis of essential hypertension.

Key word:essential hypertension;arteries;muscle,smooth;phospholipase C;G_αq subunit

许多实验证实：血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,AngⅡ）、去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）、血管加压素、血小板衍化生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF）等，与培养的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）作用时，可使磷脂酶C（phospholipase C,PLC）活化并产生三磷酸肌醇（inositol 1,4,5-trisphosphate, IP₃）和甘油二酯（1,2-sn-diacylglycerol, DAG）二个第二信使分子，最终导致平滑肌细胞收缩、血管壁张力增高及细胞的增生和肥厚^［1～3］。自发性高血压大鼠（SHR）的主动脉VSMCs，在受外来刺激（如AngⅡ、NE、GTPrS、PDGF等）时，PLC被活化程度远高于正常血压的Wistar Kyoto大鼠（WKY）主动脉VSMCs^［4，5］。由此提示PLC介导的磷酸肌醇信号途径异常，在高血压病的发生和发展中可能起着重要的作用。但现有的实验结果均来自对动物的研究，而且大多数来自培养的VSMCs，对人体则无直接的研究。基于此，本研究以人动脉平滑肌组织作为研究对象，了解PLC介导的信号传导途径与高血压病的关系。

对象与方法

1材料与试剂

1.1材料：选用本院1995年11月～1996年11月间部分因外科手术切除组织的大网膜中较大系膜动脉平滑肌层组织，置液氮中保存待用。按是否伴有原发性高血压分为高血压组和对照组二组。高血压组9例，男5，女4，平均年龄66.8±6.5岁，病程6年～40年（16.5±7.9年），均有高血压病家族史，按照1978年WHO建议的高血压及其分期标准，均属高血压病Ⅱ期，但不伴冠心病、糖尿病、高脂血症等，长期或间断服用降压药物，术前血压控制在130～150/80～90 mmHg。对照组15例，其中男8，女7，平均年龄63.5±6.9岁，两组间年龄、性别具有可比性。

1.2试剂：42kDa抗兔G_αq多克隆抗体（DuPontNEN,批号：PE021），抗牛 PLC-β₁单克隆抗体（Upstate Biotechnology,批号：12495）,抗牛PLC-γ₁单克隆抗体（Upstate Biotechnology,批号：14269）,Hybond-C（Amersham, 批号：68566)，ECL（Enhanced chemiluminescence）Kit（Amersham, 批号：RPN2209)，DTT（SERVA,批号：20710）,Leupeptin（Sigma, 批号：103476-89-7），PMSF(GIBCO，批号：11038D)，预染蛋白分子量标准(GIBCO，批号：26041-020)，辣根过氧化物酶交联的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG及其余相关试剂均购自华美生物工程公司上海分公司。

2方法

2.1平滑肌组织抽提液的制备：剪取保存于液氮中的动脉平滑肌层组织约200 mg，加于3 ml新鲜配制的蛋白裂解液中（50 mM Tris-Cl PH7.5, 1 mM EGTA, 1% TritonX-100，2 mM PMSF, 0.1 mM DTT, 2μg/ml Leupeptin），冰浴下高速匀浆15 s，将匀浆液转移至5 ml离心管，于4℃12,000 g离心5 min后，取上清，小份分装保存于-60℃冰箱，同时用Folin-酚法测定蛋白质含量。

2.2十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Immunoblot）杂交：

样品制备：每个标本取总蛋白10 μg，加入1/4体积的4×加样缓冲液（250 mM Tris-HCL PH 6.8, 30% 甘油，8% SDS，200 mM DTT，0.05% 溴酚蓝)，水浴煮沸3 min使其变性。

SDS-PAGE并将蛋白质转移至硝酸纤维素膜^［6］：将经上述制备的变性蛋白质样品，于分离胶为10%（第一抗体为抗G_αq时）或7.5%（一抗为抗PLC-β₁、-γ₁时）丙烯酰胺浓度的SDS-PAGE（Bio-Rad 80×100 mm）电泳分离后，转移至硝酸纤维素滤膜上。转移缓冲液配比为25 mM Tris，192 mM甘氨酸pH8.3，20% 甲醇及0.05% SDS。

免疫印迹杂交：转印的硝酸纤维素滤膜用TBST（20 mM Tris-HCl pH 7.4，140 mM NaCl，0.1% Tween-20）短暂漂洗后，于封闭液（含有5%脱脂奶的TBST）中室温下封闭至少0.5 h。而后与稀释于含0.02% NaN₃的封闭液中的第一抗体温浴，4℃过夜。抗兔G_αq多克隆抗体以1:1000稀释，抗牛PLC-β₁、-γ₁单克隆抗体以1 μg/ml稀释。次日，经TBST数次洗膜后，与第二抗体辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔（一抗为抗G_αq时）或山羊抗鼠（一抗为抗PLC-β₁、- γ₁时）IgG于室温下温浴1 h。再用TBST洗膜至少1 h，期间更换TBST 4～5次。吸干滴水后，将膜于ECL试剂中准确温浴1 min，并用X光片曝光显影。曝光显影的免疫印迹X光片，置激光光密度图象扫描仪(PHARMACIA)测定各信号条带的积分吸光值。

3数据的处理:以各信号条带的积分吸光值代表G_αq和PLC-γ₁的相对含量。二组G_αq相对含量采用t检验，PLC-γ₁相对含量采用M-W检验。应用SPSS统计软件包进行统计分析处理，P＜0.05为差异具有显著性意义。

结果：

1PLC同功酶在动脉平滑肌组织中的分布及与血压关系:

以分别能检测150 kDa PLC-β₁和100 kDa PLC-γ₁的单克隆抗体作探针，用免疫印迹分析方法检测PLC同功酶在人动脉平滑肌组织中的分布及含量，结果未检测到PLC-β₁，但有PLC-γ₁。图1所示为以PLC-γ₁单克隆抗体作为探针所得的免疫印迹ECL曝光显影图。其中，1～5为高血压病组，6～12为对照组，左边显示蛋白分子量标准，单位为kDa。每个加样孔所用蛋白量为10 μg，SDS-PAGE分离胶中丙烯酰胺浓度为7.5%，第二抗体为辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG。PLC-γ₁的相对含量，在高血压病组为0.740±0.275, 对照组为0.941±0.571, 两组间比较无显著性差异（u=0.78, P＞0.05）。

图 1:PLC-γ₁单克隆抗体为探针的免疫印迹ECL曝光图

2两组间动脉平滑肌组织中G_αq蛋白含量对比:

以抗兔G_αq多克隆抗体作为探针所得的免疫印迹ECL曝光显影图见图 2。其中，1～5为高血压病组，6～12为对照组，左边显示蛋白分子量标准，单位为kDa。每个加样孔所用蛋白量为10 μg，SDS-PAGE分离胶中丙烯酰胺浓度为10%，第二抗体为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG。G_αq多克隆抗体作为第一抗体，可检测42 kDa G_αq。G