摘要：目的: 探讨槲皮素(Que)对血管平滑肌细胞胞内游离钙浓 度（［Ca²⁺］i）的影响。方法：采用新一代钙荧光探剂Fluo-3/AM检测Que对培养的兔主动脉血管平滑肌细胞(ASMC) ［Ca²⁺］i 在高K⁺、去甲肾上腺素(NE)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激作用下的改变，并与Verapamil进行对照研究。结果：Que(10^-6、 10^-5、10^-4mol/l)呈剂量依 赖性抑制高K⁺去极化引起的［Ca²⁺］i 升高，与Verapamil作用相似,但弱于Verapa mil；Que (10^-6～10^{- 4}mol/L)对NE,AngⅡ 通过受体介导引起的［Ca²⁺］i 增高也具有明显的抑制作用。但Que对静息状态的ASM C［Ca²⁺］i 无明显影响。结论:Que通过对血管平滑肌细胞电压依赖性钙通道和受体 操纵性钙通道双重抑制作用，降低细胞内游离钙水平，这可能是其舒血管降压机制之一。

分类号：R589.5;Q46;Q2;R972文献标识码：A

文章编号：1006-2866(2000)01-0055-03

Effects of Quercetin on Intracellular Free Calcium Concentration in Cultured Rabbit Aortic Smooth Muscle Cells

LI Jiafu

（Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Luzhou Medica l College, Luzhou）

ZHANG MaoshunWANG JialiangFU ZongyinLIAO Xiao yang

（Department of Cardiology, First Affiliated Hospital, WCUMS,Chengdu 610041）

ABSTRACT：Aim：To explore the effects of q uercetin (Que) on intracellular free c alcium(［Ca²⁺］i) in vascular smooth muscle cells.Methods: The effects of Que on changes in ［Ca²⁺］i were determined in cultured rabbit aortic smoot h muscle cells(ASMC) after exposure to high K⁺,norepinephrine(NE) and angioten sinⅡ(AngⅡ). Fluorescent Ca²⁺-indicater fluo-3/AM was used. The effects of Que were compared with that of verapamil.Results: It was found th at Que (10^-6～10^-4mol/L) inhibited the elevation of ［Ca²⁺ ］i induced by high potassium-depolarization in a concentration dependent manner. These effects w ere similar to but weaker than those of verapamil. In addition,it was shown tha t Que (10^-6～10^-4mol/L) inhibited the elevation of ［Ca²⁺］i induced by NE an d Ang Ⅱ in the presence of extracellular Ca²⁺. In the absence of extra cellul ar Ca²⁺,Que (10^-6～10^-4)mol/L also had some blocking effects on the NE-induced ［Ca²⁺］i increase.

Conclusions: The results suggest that Que mighit decrease th e ［Ca²⁺］i of ASMC by blocking both voltage-dependent calcium channels and receptor-operated calcium channels,which is one of hypotensive mechanisms.

Key Words：quercetin;vascular smooth muscle cells;intrac ellular free calcium;rabbit▲

近年来研究发现，醋柳黄酮(Total Flavonoids of Hippophae Rhamnoides L,TFH) 有良好的扩张血管 、缓解心绞痛、降低血压、保护心肌缺血/罐注损伤等多种心血管效应 ［1 、2、3］。但其作用机制未完全明了。槲皮素（Quercetin,Que)是TFH的主要单体之一。 有研 究显示Que的扩张血管作用可能与拮抗钙离子转运有关^［4］。本实验研究观察Que对 培养的兔 主动脉血管平滑肌细胞 (ASMC)在不同刺激条件下胞内游离钙浓度（［Ca²⁺］i）的影 响，以初步探讨其舒血管降压机制，为黄酮类药物在高血压防治中的应用提供实验依据。

MATERIALS AND METHODS

1 主要药品及试剂: Que由美达康药业有限公司提供 (纯度＞98%);Verapamil(Ver) 购自德国基诺药厂； 去甲肾上腺素(NE)为上海禾丰制药有限公司产品;HEPES,Fluo-3/AM,AngiotensinⅡ(AngⅡ) ,EGTA均购于Sigma公司;A23187为美国CNI公司产品,其他试剂均为国产分析纯。

2 兔主动脉血管平滑肌细胞培养: 根据文献^［5］采用贴块法培养。无菌取出新西兰大白兔(华西医大实验动物中 心提供) 胸主动脉，去除血管内皮及外膜将中膜剪成 1 mm大小组织块,置于培养瓶贴壁培养。待2周 左右,长出单层细胞，呈典型“峰”、“谷”样生长,并进行传代。在光镜、电镜下鉴定。

3 ASMC游离钙浓度测定:参照文献^［6］将ASMC(2.5×10⁴细胞/ml)培养在13 mm玻璃片上, 待细胞生长融 合,用钙荧光探针Fluo-3/AM负载处理。在37℃恒温下,采用RF-5000pc型荧光分光度计(日 本、岛津)进行荧光强度测定。参数：Ex Bandpass 5 nm,Em Bandpass 10 nm；λex 505 nm,λem 526 nm,Re sponse 2 s。分别检测Que对高K⁺，NE，AngⅡ等激动剂引起［Ca²⁺］i 升高的作 用,测定前预先将Que加入各样品中孵育6 min,再分别加入上述激动剂；对照组则只加入激动 剂;空白组不加入任何药物干预测定静息状态钙荧光值(F)。然后加入A23187(10^-5mol/L),读取最大荧光值(Fmax) ，最后加入EGTA(5 mmol/L)，读取最小荧光值(Fmin)。按下式计算出细胞内Ca²⁺浓度 (nmol/L)：［Ca²⁺］i =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)，Kd=450 nmol/L为Ca²⁺与Fluo -3/AM解离常数。

4 统计分析：数据均用±s表示,组间比较用t检验。

RESULTS

1 Que对静息状态ASMC［Ca²⁺］i 的影响: 静息状态下培养的单层兔主动脉血管平滑肌细胞［Ca²⁺］i 为126.77±8.54 nmol/L(n=15)。在Que (10^-4mol/L)、Ver(10^-5mol/L)作用下,分别为125. 36± 7.92 nmol/L,124.16±9.76 nmol/L,对静息状态［Ca²⁺］i 均无明显影响(n=5,P 均＞0.05)。

2 Que对高K⁺去极化引起［Ca²⁺］i 升高的抑制作用: 高KCl(70 mmol/L)使膜去极化作用，明显增加ASMC［Ca²⁺］i ,由127.90± 10.51 nmol/L增至614.91±39.04 nmol/L(n=5,P＜0.01)。当预先分别加入Que 10^-6、10^-5、10^-4mol/L，再加入KCl（70 mmol/L ），则使升高的［Ca²⁺］i 分别下降了27.06%,41.08%,67.95%，呈剂量依赖性降低［Ca²⁺］i（P均＜0.01 ）; 在同样条件下，Ver(10^-5mol/L)使升高的细胞内钙降低了70.09%，与同剂量的Que相 比P＜0.01，具有统计学义,见Fig 1。

Fig 1 Effects of inhibition of Que(10^-6～10^-4mol/ L) and verapamil(10^-5m ol/L) on

high K⁺ (70 mmol/L) induced ［Ca²⁺］i elevation in cultured ASM C from rabbit.

(±s,n=5) **P＜0.01 compared with KCl; ##：P＜0.01 compared

with Que (10^-5mol/L)；△△：P＜0.01 compared with Ver+KCl

3 Que对NE引起［Ca²⁺］i升高的抑制作用:当有细胞外钙存在时（胞外钙浓度为1.8mol/L），NE（10^-5mol/L）使ASMC［Ca^{2 +}］i明显升高，由静息状态的127.34±8.68 nmol/L 增至445.10±29.67 nmol/L (P＜ 0.01, n=5)。无细胞 外钙存在下，则ASMC静息状态［Ca²⁺］i降为71.95±5.41 nmol/L, NE(10^-5mo l/L)使胞内贮存钙释放，［Ca²⁺］i升至178.76±13.54 nmol/L (P＜0.01, n =5)。Que (10^-6、10^-5、10^-4 mol/L)对NE（10^-5mol/L）在有或 无胞外Ca²⁺存在下引起的［Ca²⁺］i升高,均具有明显的抑制效应(P＜0.01) ,(Fig.2)。

Fig 2 Effects of inhibition of different concentration Que on NE( 10^-5mol/L) induced

［Ca²⁺］i elevation in cultured ASMC from r abbit in the presence and absence of external calcium

:NE(control);

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