关键词： 卒中型自发性高血压大鼠；基因组DNA；随机扩增多态性分析

摘要目的：寻找卒中型自发性高血压大鼠卒中相关基因的遗传标记。

方法和结果：用60个随机引物对自发性高血压大鼠（SHR）和卒中型自发性高血压大鼠(SHRsp)两个品系基因组DNA进行随机扩增多态性分析(Random Amplified Polymorphic DNAs，RAPD)，找到一个仅存在于SHRsp而不存在于SHR的特异性DNA片段，此片段长630bp，命名为SHRsp-630。应用SHRsp-630为探针，经Southern blot杂交证实，该序列在SHRsp为强阳性而在SHR为弱阳性。经测序和GenBank查询，证实SHRsp-630为新序列，GenBank序列编号为G38021。

结论：SHRsp-630 可能是与卒中相关基因紧密连锁的RAPD标记。这将有助于我们了解脑卒中发生的分子遗传学机制。

要点：应用随机扩增多态性分析(RADP)技术在筛送和寻找SHR和SHRsp之间遗传标记的差异，在SHRsp种系中发现一个在SHR种系中所没有的遗传标记。根据序列分析结果并经Genbank数据库证实为一种新序列，序列号定为G38021。这是有关脑卒中基因的新发现。

中图分类号：R743.3;Q781;Q756文献标识码：A

文章编号：1006-2866(1999)04-0357-04

Identification of Markers Linked to Stroke-related Genes by Random Amplified Polymorphic DNAs Technique

WEI Yingjie,DING Jinfeng,LIU Dongqing

(Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital,CAMS and PUMC,Beijing 100037,China)

ABSTRACT Aim:To search for the genetic markers linked to strok-related genes in SHRsp.

Methods：Using 60 random primers,genomic DNAs from SHR and SHRsp were analysed by RAPD (Random Amplified Polymorphic DNAs) technology.

Results:One DNA fragment existing only in SHRsp,but not in SHR,was identified.This DNA fragment was 630 bp,and named SHRsp-630.Strong positive hybridization signal was found in SHRsp,and weak positive hybridization signal in SHR,by using SHRsp-630 as an hybridization probe on Southern blot.DNA sequence analysis and GenBank inquery confirmed that SHRsp-630 is a novel DNA fragment.The GenBank accession number is G38021.

Conclusion：SHRsp-630 may be a RAPD marker linked to stroke-related genes.

Key Words：SHRsp;Genomic DNA;RAPD technology

高血压是严重危害人类生命健康的心血管疾病之一，脑卒中作为高血压的并发症又是导致高血压患者死亡的重要原因之一。因此，研究脑卒中的发生机制具有十分重要的意义。

本研究选用遗传背景极为相似的自发性高血压大鼠和卒中型自发性高血压大鼠作为比较对象，应用随机扩增多态性分析(RADP)技术筛选和寻找卒中相关基因的连锁标记，这对于防治脑卒中具有重要的理论意义和实际意义。

RAPD(Random Amplified Polymorphic DNAs)技术是九十年代发展起来的一种新的寻找DNA多态性的方法^{［1，2，3］}。其基本原理是：采用合成的单个随机引物（一般为10个碱基），模板DNA经92～94℃变性解链，在足够低的温度下（35℃～37℃）与随机引物退火，如果两个退火位点足够接近（约200 bp～2000 bp），且分别位于互补的两条DNA链，通过PCR便可扩增出DNA片段。由于不同种属的基因组DNA可能存在插入、缺失或者退火位点发生碱基改变，扩增产物的长度就有所不同，这可以用电泳得以检测DNA扩增片段长度的多态性，分析DNA扩增片段长度的多态性可以得到相应的DNA在遗传、分类、进化等方面的信息。

RAPD技术的优越性在于：(1)技术简便；（2）不涉及放射性；（3）不需要物种特异之探针；（4）花费相对较低；（5）多态性水平高；（6）对整个基因组巡查；（7）只需少量DNA样品。

采用RAPD 技术，Michelmore等人^［4］用100个随机引物找到了三个与莴苣霜霉病抗性基因连锁的遗传标记；Martin等人^［5］用144个随机引物对番茄近等位基因系进行RAPD分析，坚定了与番茄pto基因连锁的标记。我们采用RAPD技术，筛选和寻找SHR和SHRsp之间遗传标记的差异，已经在SHRsp种系中找到一个在SHR种系中所没有的遗传标记。

MATERIALS AND METHODS

1 实验动物和材料

SHR和SHRsp为本院实验动物部繁殖，均为12周龄。其中SHR 6只，雌雄各半，SHRsp 6只，雌雄各半。

所有60个随机引物均由10个核苷酸组成，皆由加拿大生工公司合成。引物序列如下：

AP1：GTTTCGCTCC;AP2：TGATCCCTGG;AP3：CATCCCCCTG

AP4：GGACTGGAGT;AP5：TGCGCCCTTC;AP6：TGCTCTGCCC

AP7：GGTGACGCAG;AP8：GTCCACACGG;AP9：TGGGGGACTC

AP10：CTGCTGGGAC;AP11：CAGGCCCTTC;AP12：TGCCGAGCTG

AP13：AGTCAGCCAC;AP14：AATCGGGCTG;AP15：AGGGGTCTTG

AP16：GGTCCCTGAC;AP17：GAAACGGGTG;AP18：GTGACGTAGG

AP19：GGGTAACGCC;AP20：GTGATCGCAG;AP21：AAAGCTGCGG

AP22：TGTCATCCCC;AP23：AAGCCTCGTC;AP24：TGCGTGCTTG

AP25：GACGGATCAG;AP26：CACACTCCAG;AP27：TTCCCCCCAG

AP28：TGAGTGGGTG;AP29：GTTGCCAGCC;AP30：ACTTCGCCAC

AP31：ACGGATCCTG;AP32：GAGGATCCCT;AP33：CCTGATCACC

AP34：GGTGATCAGG;AP35：CCGAATTCCC;AP36：GGGAATTCGG

AP37：CCGATATCCC;AP38：GGGATATCGG;AP39：CCAAGCTTCC

AP40：GGAAGCTTGG;AP41：AACGGTGACC;AP42：ACCTGGACAC

AP43：GGAGGAGAGG;AP44：CAGAAGCCCA;AP45：CCGCCTAGTC

AP46：TGTTCCACGG;AP47：AAGGCGGCAG;AP48：CAGCGACAAG

AP49：TTTGCCCGGT;AP50：TGGAGAGCAG;AP51：CCAGCTTAGG

AP52：CCGCCCAAAC;AP53：TCTGTCGAGG;AP54：CACCTTTCCC

AP55：AGCGAGCAAG;AP56：GAACACTGGG;AP57：CCCTACCGAC

AP58：GTGCAACGTG;AP59：AATGCCCCAG;AP60：TGGCCCTCAC

PCR反应所使用的Taq酶均为Gibcol公司产品。探针标记采用Promega公司的切口平移标记试剂盒。

2 实验方法

2.1 基因组DNA的提取:采用低渗溶血法提取白细胞基因组DNA。

2.2 PCR反应及分析: 扩增反应总体积为25μl，内含5μl随机引物5μM;1μl MgCl₂ 50 mmol;2.5 μl 10×PCR buffer;1μl dNTPs 5 mmol;2 μl Genomic DNA 50 ng/μl;0.2 μl Taq polymerase 5U/μl;加水至25 μl。 循环参数：94℃,3 min→94℃,1 min；36℃,1.5 min；72℃,2 min，共进行45个循环→72℃,10 min。扩增产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳分析。

2.3 目的DNA片段的回收: 采用冻溶法从琼脂糖凝胶中回收DNA，具体操作如下：(1)切下含有回收DNA片段的胶块，置于1.5 ml离心管中；(2)用玻璃棒将胶块捣碎，加等体积的平衡酚混匀后，置液氮10 min；(3)取出后立即离心，5000 g × 5 min；(4)小心地将水相转移至另一1.5 ml离心管中；(5)在原1.5 ml离心管内加200 μl TE buffer (pH 8.0)，充分混匀，再次用玻璃棒捣碎，置液氮10 min；(6)离心，5000 g × 5 min，将水相转移合并；(7)加等体积酚抽提一次（pH 7.8）；(8)加等体积氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次；(9)在转移出的水相中加1/10体积3 mol乙酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇置液氮10 min；(10)．离心，12 000 g × 15 min ,弃上清，70%乙醇洗一次，空气干燥10～15 min；沉淀溶于10μl H₂O中，-20℃保存备用。

2.4 探针标记: 用Promega公司的Nick Translation System标记试剂盒，按说明书进行目的片段的标记和纯化。

2.5 Southern杂交^［6］: 6个SHR的基因组DNA等量混合，6个SHRsp的基因组DNA等量混合。各取10 μg，经EcoR I酶切、1%琼脂糖电泳后，转移至尼龙膜上，进行探针与各基因组DNA的杂交和自显影检测。

2.6 核苷酸序列测定: 将回收的目的DNA片段克隆入pGEM-T Easy载体，转化细菌，挑选白色克隆，酶切鉴定，然后应用ABI377全自动测序仪进行序列测定。

RESULTS

1 DNA的质量和纯度鉴定: SHR和SHRsp的基因组DNA的电泳结果和紫外吸收曲线如Fig 1和Fig 2。所提取的每个SHR和SHRsp的基因组DNA的纯度