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摘要目的：应用再狭窄动物模型，研究血管成形术后血管平滑肌细胞增殖的分子机制。
方法：对家兔实施血管成形术后，分别在术后3、7和14天提取实施手术组和对照组的血管总RNA，应用差异显示技术观察血管成形术后基因表达的改变。
结果：我们分别在三个时间点上发现了7个仅在实施血管成形术的血管表达而在正常对照血管无表达的表达序列标签(Expressed Sequence Tags,ESTs)。尽管这7个ESTs经序列测定和GenBank查询均为新的ESTs，但经杂交证实仅有一个EST在损伤血管高表达，而在对照血管表达极低，它可能与血管成形术后血管平滑肌细胞的增殖有关。
结论：本研究应用差异显示技术观察了血管成形术后基因表达的改变。利用这一技术可以帮助我们了解疾病动物模型基因表达的变化，这也可能是发现疾病相关基因的一条有效途径。
要点：应用差异显示技术分别于血管成形术后的血管处发现7个特殊的序列标签(ESTs)，经序列测定和Genbank查询均为新的ESTs。经与血管总cDNA杂交后仅新序列A明显高于对照血管，其余在损伤血管上与对照组表达无差异。
中图分类号：Q46;Q781文献标识码：A
文章编号：1006-2866(1999)04-0352-05
Identification and Cloning of Smooth Muscle Cell Proliferation -Related ESTs after Angioplasty
WEI Yingjie,DING Jinfeng,XU Youyuan,QIAN Jie,GAO Runlin
(Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital,CAMS and PUMC,Beijing 100037,China)
ABSTRACT Aim:To study the molecular mechanisms of vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation after angioplasty in the experimental rabbits.
Methods:Balloon angioplasty of the rabbit abdominal artery was performed,and tissues were examined from control animals and from animals,3 days,7 days,and 14 days after the operation.Total RNA was isolated,and differential display was performed to identify mRNA transcripts whose expression was modulated in a temporal fashion after balloon angioplasty.
Results:Using total RNA isolated from vessels excised from control rabbits and rabbits up to 14 days,we describe seven differentially regulated transcripts by differential display.By cDNA dot blot,only one of the angioplasty-induced transcripts at day 7 is highly expressed in vessels from experimental rabbit,and lowly expressed in those from control rabbits,although DNA sequence analysis has identified all of these seven ESTs (Expressed Sequence Tags) as novel sequences.
Conclusion:In this study,we describe in vivo application of the differential display technology in a rabbit abdominal artery angioplasty model to identify mRNA transcripts whose expression is modulated selectively in vessels undergoing neointima.Using models of experimental induced disease should facilitate our understanding of gene expression patterns in pathogenesis and may serve as a reliable technology to find disease-related gene.
Key Words: angioplasty;restenosis;differential display;ESTs
冠心病的介入性治疗—经皮腔内冠状动脉血管成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)是心血管病治疗学上的一大进步,挽救了千百万人的生命,其成功率可达95%以上。但是，介入治疗后3～6个月约有30%～50%的患者会出现再狭窄(Restenosis)，明显降低了其远期疗效［1,2］。因此，研究探讨再狭窄的发生机制具有十分重要的意义。关于再狭窄的发生机制目前并不十分了解，血管平滑肌细胞(VSMC)迁移、过度增殖和大量合成细胞外基质可能是导致血管内膜增厚、管腔狭窄的主要原因。
再狭窄的发生依其病理发展过程大致可以分为五个阶段［3］：(1)血栓形成期:这一阶段发生在血管成形术后的1～12小时之内。系由于血管成形术对内皮细胞的损伤、血管内膜和血管基底膜的暴露、血管内皮的屏障和保护功能降低、血管牵张及血流的刺激等所引起的，其中内皮细胞的损伤是再狭窄的启动因素;(2)炎症期：炎症期发生于PTCA后即刻，约可持续7天左右，这亦是由内皮细胞损伤所引起的。内皮细胞损伤、胶元暴露、血小板粘附可以产生单核细胞趋化因子和粘附分子，可以促进单核/巨噬细胞和T淋巴细胞附着及向内膜下浸润；浸润和活化的巨噬细胞及淋巴细胞自身还可合成分泌多种细胞因子、生长因子及趋化因子，进一步促进白细胞的浸润，从而引起局部的炎症反应;(3)血管平滑肌细胞增殖期：血管成形术后24 h～72 h，VSMC即开始增殖，7 d～14 d后达到最高峰，约可持续1～2个月。在增生的内膜中，血管平滑肌细胞约占总细胞的80%以上;(4)血管“再塑”： 血管的“再塑”（Remodeling）主要指血管壁细胞，尤其是中层VSMC的内膜下迁移、增生、肥大、细胞外基质聚积和纤维化、细胞的重排，壁/腔比例和几何形状的改变。血管再塑包括受损血管的缩窄和代偿性病变血管增粗。血管的缩窄是内膜下增生的结果；代偿性血管增粗可能是缩窄的血管增加了管壁剪切刀，血流加速及内弹力层代偿性增厚的结果。因此，血管再塑是内膜损伤后血管修复反应的结果，是产生再狭窄的根本原因。
目前还没有一种药物对防治PTCA术后再狭窄的发生具有满意的疗效，这主要是由于我们对再狭窄发生的确切机制还不十分了解。利用球囊剥脱实验动物血管内皮可以复制出与PTCA术后类似的病理，即内膜的增生和血管平滑肌细胞的迁移和增殖情况。这样就为我们研究血管成形术后血管平滑肌细胞增殖的分子机制提供了有利的条件。
血管成形术后VSMC增殖的本质是基因表达的改变。以往研究mRNA差异表达的通用方法是mRNA的差减杂交技术，这种方法花费大、成本高、时间长、推广困难。1992年梁鹏等建立了一种新的显示mRNA差异表达的技术，在一定程度上克服了差减杂交方法的不足。这种方法称为mRNA差异显示（mRNA differential display）或差异显示反转录 PCR(differential display reverse transcription PCR,DDRT-PCR)［4］。它是将mRNA 反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术，目前已广泛用于分离鉴定组织特异性表达的基因。以往对于再狭窄的研究主要侧重于某一因素、 某一基因表达的变化与再狭窄的关系，如多种血管活性物质、各种生长因子与再狭窄的关系。本工作拟在血管成形术后血管平滑肌细胞增殖初期的不同阶段，全面地捕捉究竟是哪些基因表达的改变参与了再狭窄血管平滑肌细胞的增殖过程，这对于阐明再狭窄发生的分子机制具有一定的帮助，同时也对再狭窄的防治具有一定的参考价值。
MATERIALS AND METHODS
1 实验设计: 本实验选用新西兰纯种白兔，雄性，体重3.0 kg，饲喂高胆固醇饲料(1 g/只/d)8周后，将动物分为三组，分别为:(1)实验组(Ⅰ组)：拉伤腹主动脉；(2)自身对照组(Ⅱ组)：拉伤腹主动脉家兔的胸主动脉；(3)正常对照组(Ⅲ组)：未受拉伤家兔的腹主动脉。 分别以拉伤后3天、7天和14天的拉伤血管的总RNA及相应的自身对照组和正常对照组的总RNA为实验材料，做差异显示分析，挑选仅在Ⅰ组中有特异表达，而在Ⅱ组和Ⅲ组中均无表达的条带做为阳性条带，将其克隆后进行杂交证实和序列分析，为该片段所代表基因的功能研究奠定基础。
2 实验方法：
2.1 球囊导管损伤家兔腹主动脉模型的建立［5］：雄性新西兰白兔，体重3.0 kg。肌注氯氨酮12 mg/kg麻醉，局部消毒后行股动脉切开术，插入4F Fogarty球囊导管至腹主动脉，将球囊内注入0.3 ml生理盐水，使球囊扩张，然后回拉导管，剥脱腹主动脉内皮3次；结扎股动脉，缝合伤口，肌注青霉素80万单位以防感染。
2.2 引物:
锚定引物：
5'-TTTTTTTTTTTTA-3';5'-TTTTTTTTTTTTG-3';5'-TTTTTTTTTTTTC-3'
随机引物：
AP-1：GTTTCGCTCC;AP-2：TGATCCCTGG
AP-3：CATCCCCCTG;AP-4：GGACTGGAGT;
AP-5：TGCGCCCTTC;AP-6：TGCTCTGCCC
AP-7：GGTGACGCAG;AP-8：GTCCACACGG;
AP-9：TGGGGGACTC;AP-10：CTGCTGGGAC;
AP-11：CAGGCCCTTC;AP-12：TGCCGAGCTG
AP-13：AGTCAGCCAC;AP-14：AATCGGGCTG;
AP-15：AGGGGTCTTG;AP-16：GGTCCCTGAC;
AP-17：GAAACGGGTG;AP-18：GTGACGTAGG
