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方法:以137例EH患者(其中Ⅱ,Ⅲ期89例)和63例健康人为对象，用PCR/DdeI酶解检测位于AT1R基因3'-UTR的A1166C突变，并用PCR检测ACE基因内含子16的插入／缺失(I/D)多态性标记。
结果：(1)EH组的AT1R基因的AC基因型和C等位基因频率明显高于对照组(AC基因型 0.23 vs 0.09,P＜0.05;C等位基因 0.13 vs 0.05,P＜0.05),尤其EH(Ⅱ,Ⅲ)组显著高于对照组(P＜0.01)；（2)EH组的ACE基因的DD基因型及D等位基因频率与对照组比较无明显差别P＞0.05)，但EH(Ⅱ,Ⅲ)组的DD基因型及D等位基因频率却显著高于对照组(P＜0.01)；(3)AT1R基因和ACE基因的多态性对EH的影响作用可能独立于年龄、BMI、血压、血脂以及血浆PRA和AngⅡ水平;(4)EH及EH(Ⅱ,Ⅲ)患者的AT1R基因型和ACE型基因组成联合基因型的频率分布与对照组比较无统计学差异(P＞0.05);提示这两基因多态性对EH的发生发展可能无协同效应。
结论：(1)AT1R基因A1166C多态性是EH发病的独立危险因素，可能参与EH发生及其靶器官损害的过程；(2)ACE基因I/D多态性与EH发生无关，而与EH并发症呈明显相关，可能参与EH靶器官损害过程。
要点：本文同时检测ACE基因第16内含子的I/D多态性和AT1R基因3’非翻译区A1166C多态性；结果高血压患者DD和D等位频率高，A1166C中AC型的C等位频率高，但考查两种联合频率和高血压之间的关系都未达到有统计学的意义的协同作用水平。
中图分类号：R544.1;Q753文献标识码：A
文章编号：1006-2866(1999)04-0319-04
Association Between Polymorphisms of the Angiotensin Ⅱ Type 1 Receptor Gene, Angiotensin Converting Enzyme Gene in Human Essential Hypertension
YU Huizhen1，BAI Yuru2,CHEN Hui2,et al
（1. The Second Department of Internal Medicine ,Fujian Provincial Hospital; 2. Fujian Cardiovascular Disease Institute , Fuzhou, 350001.）
ABSTRACT Objective:To investigate the relationship of polymorphism of angiotensin Ⅱ type 1 receptor(AT1R) gene and angiotensin converting enzyme(ACE) gene in human essential hypertension (EH) in Chinese.
Methods:137 EH(89 cases in stageⅡ，Ⅲ and 63 normal controls were examined for the A1166C variation at the 3'-untranslated region(3'-UTR) of AT1R gene by DdeI restriction endonuclease digestion and PCR methods. The insertion/deletion polymorphism at the intron 16 of ACE gene was monitored by restriction enzyme digestion and PCR.
Results：(1) The frequencies of AC genotype and C alleles of AT1R A1166C polymorphism showed significant difference between hypertentives and controls(AC genotype is 0.23 vs 0.09, P＜0.05;allele C is 0.13 vs 0.05, P＜0.05)；(2)The frequencies of DD genotype and D alleles in EH stage Ⅱ，Ⅲ group were noticeably greater than in controls (P＜0.01);（3) The analysis of individual combined genotypes of AT1R gene and ACE gene showed no difference in frequency distribution on patients with EH and EH(ⅡⅢ)compared with controls (P＞0.05).
Conclusion：（1)The A1166C polymorphism of AT1R gene may be involved in the occurrence and development of EH, and is an independent risk factor for EH in Chinese;(2)The DD genotype of ACE gene is associated with EH with target organ damages;(3)The influence of AT1R gene and ACE gene on EH may be weakly influence on the circulating renin angiotensin system(RAS),and were independent of age,BMI, blood pressure and metalolic parameters;(4) There is no synergistic effects between the polymorphism of AT1R gene and ACE gene.
key words: Angiotensin Ⅱ type 1 receptor gene; Angiotensin converting enzyme gene; polymorphism; essential hypertension.
肾素-血管紧张素系统(RAS)是体内调节血压和水电质平衡的主要系统。该系统通过一系列酶促反应，最终发挥生理效应的物质为血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）,AngⅡ生理功能主要是通过血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R ）来完成的。近年来国外有学者研究表明AT1R 基因第1166位点上硷基突变，即A1166C多态性与白种人高血压病有相关［1］。目前有关血管紧张素Ⅱ转化酶（ACE）基因多态性与高血压病关系的结论颇不一致［2］。晚近多基因变异产生相互作用的研究，成为人们探讨多因素疾病的关心问题。本研究旨在探讨中国人群中AT1R基因和ACE基因的多态性与高血压病的相关情况，并分析这两基因间的相互作用。
MATERIALS AND METHODS
1对象：137例原发性高血压(EH)患者来自福建省立医院心内科就诊的病人，按WHO诊断标准，Ⅰ期48例、Ⅱ期53例、Ⅲ期36例，男性87例、女50例，平均年龄57.48±10.62岁，其中74例有高血压家族史［EH+FH(+)］，高血压家族史定义为父母有一方或者同胞兄弟姐妹中至少有一位患高血压病。63例正常对照(controls)，来自福建地区体检的随机无关个体，男性41例，女性22例，平均年龄56.93±12.87岁。收缩压(SBP)＜140mmHg,舒张压(DBP)＜90mmHg，家族中一级亲属没有EH病史，排除糖尿病及其它心血管系统疾病。
2 基因检测:
2.1 AT1R-A1166C变异检测: 取4 ml 静脉血常规分离白细胞和酚氯抽提DNA。A1166C变异位于3'非编码区(3'-UTR)，该变异导致限制性内切酶DdeI位点出现，可应用PCR扩增局部片段后并用DdeI水解。PCR反应引物序列:
上游引物5'ATA ATG TAA GCT CAT CCACC-3'
下游引物5'GAG ATT GCA TTT CTG TCA GT-3'
PCR反应条件，初期93℃5分钟变性后进行33个循环，每个循环中93℃ 40 s、57℃ 40 s、72℃ 1 min，最后72℃延伸10 min。反应产物经纯化后于37℃恒温水浴箱中用DdeI酶切3～4小时，以2.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下鉴定基因型：若两个等位基因上均含有内切酶识别位点，酶切后产生210 bp和140 bp，则定义为CC型；酶切后产生350 bp、210 bp和140 bp三条带、则定义为AC型；若不含酶切位点，只有一种350 bp片段则定义为AA型。(见Fig 1)
图1AT1R基因A1166C分子变异的基因型
Fig 1Genotype of angiotensin Ⅱ type 1 receptor gene A1166C variation
1:DNA marker (50 bp～1000 bp); 2: CC genotype; 3～4: AC genotype; 5～7:AA genotype.
2.2 ACE-插入/缺失(I/D)多态性检测：ACE基因第16内含子上的Alu片段呈I/D多态性,详细方法检测见［3］,基因分型见Fig 2。
图2 ACE基因 I/D 多态性的基因型
Fig 2 Genotype of angiotensin Ⅰ converting enzyme gene I/D polymorphism
1,7:ID genotype; 2, 4, 6:DD genotype; 3,5:II genotype; 8:DNA marker (50 bp～1000 bp)
3 临床表型分析:
3.1 血压、BMI（体重/身高2）
3.2糖脂代谢：空腹10小时以上取静脉血测定:空腹血糖、总胆固醇 甘油三脂以及高密度脂蛋白等。
3.3血浆肾素(RA)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的水平测定：取4 ml静脉血，注入含有ACE酶抑制剂的抗凝管，分离血浆，置-70℃冰箱，应用放免法测定血浆RA浓度和AngⅡ活性水平。
4统计方法：用SPSS统计软件处理数据：各临床参数于三组间及两种基因的不同基因型间比较采用ANOVA分析方法，计量数据结果用均数±标准差表示，基因型及等位基因频率分布采用卡方检验和Fisher精确概率法，相关因素参与发病的独立性，应用logistic逐步回归分析。显著性水平P=0.05。
RESULTS
1 EH组与对照组临床及生化特征比较见表1
