摘要目的:了解基础状态动物模型肾局部RAS的水平，观察其在用转换酶抑制剂（ACEI）和血管紧张素受体拮抗剂（AT₁RA）干预治疗后的变化，探讨、比较这两种药物对肾保护作用的分子生物学机制。

方法：用反转录聚合酶链反应（RT-PCR），分别对自发性高血压大鼠 (SHR)肾皮质内ACE和AT₁受体mRNA表达进行测定，观察用ACEI或AT₁RA干预治疗后的变化。

结果:(1)与WKY比，基础状态下SHR肾皮质内ACE和AT₁受体mRNA表达均显著升高（两组P＜0.05）；(2)与对照组相比，用ACEI后SHR肾皮质内ACE mRNA被抑制（P＜0.05），但AT₁受体mRNA无变化；(3)与对照组相比，用AT₁RA后，SHR肾皮质内ACE 和AT₁受体mRNA均被抑制（两组P＜0.05）。

结论:ACEI和AT₁RA都对SHR局部RAS有作用，但作用机理和途径可能不同，AT₁受体可能存在多方面调节机制。ACEI似乎仅作用于ACE，对AT₁受体可能没有直接作用；AT₁RA在作用于AT₁受体的同时，可能还通过旁路途径作用于ACE。

要点：SHR肾皮质局部ACE mRNA表达在依那普利干预后明显受抑制，而AT₁受体mRNA表达无改变。Losartan干预后两者的mRNA均明显被抑制，可能由于AT₁受体受拮抗后AngⅡ浓度升高，负反馈抑制ACE mRNA,或有旁路参与调节。

中图分类号：R544.1;R972;Q555;Q781文献标识码：A

文章编号：1006-2866(1999)04-0368-03

The Comparison the Effect of ACEIs and AT₁RA on Renal RAS

LIU Xiaoping, GUO Jizhen, GAO Pingjin, ZHU Dingliang

(Shanghai Institute of Hypertension, Rui-jin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200032)

ABSTRACT Objective: To investigated the local RAS level in kidney of rats and its changes after the interventions of ACEI and AT₁RA in order to explore the molecular mechanism of the protective effects on kindey of these two drugs.

Methods:Used RT-PCR to detect the ACE and AT₁ mRNA expressions in renal cortex of spontaneous hypertensive rats(SHR) and Wistar Kyoto rats(WKY) before and after applied ACEI or AT₁RA treatment.

Results: (1)Compared with WKY, both ACE and AT₁ mRNA expressions in SHR were significantly higher(P＜0.05);(2)ACE mRNA expression in SHR was inhibited after ACEI treatment(P＜0.05), while these was no changes in AT₁ mRNA expression;(3)ACE and AT₁ mRNA expressions in SHR were both inhibited after AT₁RA treatment.

Conclusion: Both ACEI and AT₁RA had local effects on RAS in SHR, but their mechanisms might be differenct. It was suggested that AT₁ receptor had multipule regulations pathways. ACEIs seems solely affect on ACE, while no direct effect on AT₁ receptor was found. However, AT₁RA might have effect on ACE through regulation of AT₁ receptor.

Key words: SHR, ACEIs, AT₁RA, renal cortex, ACEmRNA, AT₁ receptor mRNA

细胞生物学研究显示^［1］，基础状态下，自发性高血压大鼠（SHR）的肾小球系膜细胞表现为增殖异常活跃，ACEI能明显抑制这种增殖。我们过去的临床及药理学研究^［2］均提示，ACEI不仅具有降压作用，对肾脏还具有改善肾血流的作用。分子生物学研究结果提示^［3］ACEI对于局部RAS还具有直接作用 。新一代药物AT₁受体拮抗剂（AT₁RA）的运用，为进一步研究局部RAS提供了又一有效手段。

我们观察了SHR, WKY大鼠，分别用ACEI，AT₁RA干预治疗，对动物肾皮质内ACE和AT₁受体mRNA表达进行分子生物学测定，探讨肾局部RAS在原发性高血压发病中的作用与调节机制，并对ACEI和AT₁RA的肾保护作用进行研究。

MATERIALS AND METHODS

1 动物：雄性，六周龄大鼠，WKY31只，SHR24只。购自上海市高血压研究所动物房。

2 主要试剂和仪器：

2.1 DEPC(Diethyl pyrocarbonate)：美国Sigma公司产品。

2.2 RNA抽提试剂(Trizol)：美国Gibco Brl公司产品。

2.3 鼠白血病病毒反转录酶(MMLV reverse transcriptase)及5×缓冲液：美国Gibco Brl公司产品。

2.4 随机引物（Random primer）：美国Promega公司产品。

2.5 DNA合成酶（Taq DNA Polymerase）及10×缓冲液，四种底物（dNTP）：美国Promega公司产品。

2.6 Marker:含6个DNA片段，从50～1,000碱基对。美国Promega公司产品。

2.7 PCR引物：从基因文库（Gene Bank）中查得ACE,AT₁受体基因cDNA序列。

β-actin 540 bp:

上游：5'- GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3'

下游：5'- CTCTTTGATATCACGCACGATTTC-3'

AT₁受体：人（大鼠）316 bp（第137～452 bp）

上游：5'-ACAGCTTGGTGGTGATTGTC-3'

下游：5'-ATGATGCAGGTGACTTTGGC-3'

ACE：人（大鼠）388 bp（第492～880 bp）

上游：5'-GCC(T)TCCCCAACAAGACTGCCA-3'

下游：5'-CCACATGTCTCCCAGCAGATG-3'

以上引物均由中国科学院上海细胞生物学研究所实验室合成。

2.8 悦宁定（Enalapril）和科素亚（Losartan）：美国默沙东公司。

2.9 Perkin Elmer Cetus 480热循环仪：美国PE公司;Ultrospec 3000 紫外分光光度计：Pharmacia BioTech公司;KS 400光密度图象分析仪：德国远东蔡司（Zeiss）公司。

3 实验方法：

3.1 动物分组：分别将WKY, SHR 分为对照组，悦宁定组和科素亚组。悦宁定组按10 mg/kg/d, 科素亚组按15 mg/kg/d灌胃四周。

3.2 组织提取及分子生物学实验：（1） 断头，取外周血分送生化检测外周ACE, AngⅡ水平；（2）剖腹取双肾，去包膜，剪取肾皮质，置液氮中；（3） 组织匀浆抽提RNA：取肾皮质10～20 g，采用TRIZOL匀浆，氯仿-异丙醇法抽提总RNA；（4） RT：取总RNA 2 μg，加随机引物1 μl(100 ng/μl), 加DEPC水至10 μl。置65℃水浴5 min，立即冰浴。加5×缓冲液5 μl，DTT 2 μl，dNTP 2μl，M-MLV 1 μl（200 U/μl），加DEPC水至总体积25 μl，置37℃水浴60 min，95℃水浴5 min。置-20℃保存;（5） PCR：10×缓冲液5 μl，MgCl₂ 4 μl，dNTP 3 μl，每对引物各1 μl，TaqE 0.5 μl，RT产物分别为：β-actin 6 μl;AT₁ 6 μl;ACE 12 μl, 加DEPC水至总体积50 μl。PCR条件分别为：β-actin 首次循环：94℃ 3 min，60℃ 1 min，72℃ 2 min；接94℃ 45 s, 60℃ 1 min，72℃ 45 s,29个循环，结束前72℃ 10 min。AT₁首次循环：94℃ 3 min，64℃ 1 min，72℃ 2 min；接94℃ 45 s, 64℃ 1 min，72℃ 45 s,29个循环，结束前72℃20 min。测定β-actin表达量以校正AT₁受体mRNA表达量。ACE 首次循环：94℃3 min，57℃ 1 min，72℃ 2 min；接94℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃ 1 min，26个循环，结束前72℃ 20 min。测定β-actin表达量以校正ACE mRNA表达量。;（6） 电泳：各取PCR 13 μl，加6×载样缓冲液2 μl，经2%琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE, 经0.5 μg/ml溴乙锭染色45 min，反射紫外灯下采用乐凯胶卷摄片，曝光时间15 s，经光密度扫描。因β-actin在各组织中均匀表达，故用β-actin光密度值进行标准校正。

4 统计学处理：校正值用±s表示，两组比较采用配对t检验，显著性标准为P＜0.05。

RESULTS

1 基础状态下：与WKY比，SHR肾皮质内ACE和AT₁ mRNA表达显著升高（两组P＜0.05）；如图1(A,B)

图1基础状态下，SHR肾皮质内ACE和AT₁ mRNA表达显著升高