设为首页
加入收藏
求医中医药网
www.qe.cn
站内搜索
目的为了研究自发性高血压大鼠 （SHR）胸腺功能异常的分子机制，我们用cDNA代表性差异分析cDNA representational difference analysis (RDA)技术比较了SHR与其正常血压对照 （WKY）大鼠二者胸腺基因表达的差异。方法 用cDNA代表性差异分析技术比较了SHR和WKY大鼠胸腺基因表达的差异。差异表达的cDNA接入T—载体进一步进行差异筛选。挑选阳性克隆进行测序并用BLAST软件进行同源性分析。最后用Northern杂交分析验证差异筛选的结果。结果 挑选了4个差异筛选的阳性克隆进行测序，序列同源性分析表明它们均与胰岛素-I 基因序列高度一致。Northern 杂交结果证实了胰岛素-I 基因在SHR 胸腺中表达降低。结论 运用cDNA代表性差异分析技术，结合差异筛选方法，本文观察到SHR胸腺中胰岛素-I基因表达降低，提示局部微环境中的胰岛素缺乏在SHR胸腺细胞的发育异常中可能起一定的作用。
中图分类号：Q456;Q455;Q78 文献标识码：A
文章编号：1006-2866(1999)01-0168-04
Low Expression of Insulin-I Gene in Thymus of SHR
ZHAO Xiaosong,DING Yingjiong,ZHU YiChun,WAN Dafang,YAO Tai
(National Laboratory of Medical Neurobiology,Department of Physiology,Shanghai Medical University,Shanghai 200032,China,and *National Laboratory for Oncogene and Related genes,Shanghai Cancer Institute,Shanghai 200032,China)
ABSTRACTObjective To investigated molecular events associated with the dysfunction of thymus in spontaneously hypertensive rats (SHRs),we analyzed the difference in gene expression of thymus between SHRs and Wistar-Kyoto (WKY) rats.Methods cDNA representational difference analysis (cDNA-RDA) was applied to compare the gene expression of thymus between SHR and WKY.The difference products of cDNA-RDA were cloned into T-vector for differential screening.The positive clones were sequenced ,and the sequences were analyzed by the BLAST program for homology search.Northern blot analysis was used to confirm the results of differential screening.Results Four positive clones of differential screening were picked out for sequencing.Homology analysis indicated that all of the four clone sequences were the same as that of insulin-I gene.By Northern blot analysis,insulin-I gene was confirmed to be down-regulated in SHR thymus.Conclusion By using cDNA-RDA combined with differential screening,it was found insulin-I gene is down-regulated in SHR thymus,which may be responsible for the abnormal development of thymocytes in SHR.
Key Words cDNA representational difference analysis;spontaneously hypertensive rat;thymus;insulin-I gene
1963年由Okamoto和Aoki［1］建立了人类原发性高血压病的动物模型-自发性高血压大鼠（SHR）。除了高血压和心血管并发症外，SHR也表现出各种免疫异常：外周血液中的T淋巴细胞及胸腺中前T淋巴细胞数量减少，对植物血凝集素A（PHA）和伴刀豆类蛋白A（Con A）的反应性低下［2］；血液中的T淋巴细胞随着年龄增加而进行性减少［3,4］；从1月龄始就出现胸腺细胞毒自身抗体［5］；缺乏与T细胞分化有关的胸腺激素等等［6］。这些现象都与SHR胸腺功能异常有关。1985年，巴德年等人移植正常血压大鼠胸腺或胸腺抽提物到SHR体内，可以恢复SHR的免疫功能和血压到正常水平［7,8］。然而正常血压大鼠胸腺与SHR胸腺之间功能差异的分子基础尚不清楚。
为了研究SHR胸腺功能异常的分子机制，我们用cDNA代表性差异分析［9,10］（cDNA-RDA）技术比较了SHR与其正常血压对照（WKY）大鼠二者胸腺基因表达的差异。
MATERIALS AND METHODS
1实验动物： 选择10周左右雄性SHR与WKY大鼠（由上海高血压研究所提供）用于实验。断头处死，快速取胸腺，在室温Hank氏溶液中漂洗，吸干水分后，在液氮中快速冷冻备用。
2总RNA抽提和mRNA分离： 用异硫氰酸胍一步法抽提SHR和WKY大鼠胸腺总RNA，用DEPC处理水溶。总RNA样品用紫外吸收光谱定量，OD260/OD280比值在1.8～2.0之间。经1%琼脂糖凝胶电泳分析，紫外线下观察28S/18S比值大于1.5。mRNA分离按照Oligotex mRNA Mini Kit (Qiagen,chatsworth,CA USA)操作步骤进行。
3cDNA代表性差异分析（cDNA--RDA)：按照Hubank和Schatz的方法，稍加改进，用WKY大鼠胸腺的cDNA减去SHR胸腺的cDNA，操作流程如图1所示。
图1 cDNA-RDA 实验流程示意图.WKY大鼠胸腺的cDNA
称为实验者，SHR胸腺的cDNA 称为对照者
所用引物和衔接头序列如下：
cDNA合成引物：5'-TTTTGTACAAGCTT30-3'
PCR引物1：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'
巢式引物1：5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'
巢式引物2：5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'
衔接头1：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC
CGCCCGGGCAGGT-3'
3'-GGCCCGTCCA-5'
衔接头2：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTC
GCGGCCGAGGT-3'
3'-CGGCTCCA-5'
3．1准备扩增模板片段（amplicon)：取2 μg SHR和WKY大鼠胸腺mRNA用MoMLV和 cDNA合成引物42℃逆转录合成第一链cDNA，立即加入RNase H-DNA ploymerase I-E.coli.DNA ligase酶混合物，合成第二链cDNA；经酚/氯仿去蛋白和乙醇沉淀后，用RsaI酶切双链cDNA，使成为平头的小片段。取用RsaI酶切过的WKY大鼠胸腺双链cDNA，分别与衔接头1和2连接，构成实验者（tester）1和2。用RsaI酶消化过的SHR胸腺双链cDNA不与任何衔接头连接，作为对照者(driver)。
3．2杂交和选择性扩增：
第一次杂交：分别用实验者1和2 与对照者按1：15比例混合，98℃变性1.5 min后，68℃杂交10小时。
第二次杂交：在上述两个杂交溶液的一个中加入10倍于实验者cDNA量的新鲜变性的对照者cDNA，迅速把两份杂交溶液混合，继续68℃杂交12小时。
PCR扩增：杂交溶液用稀释缓冲液［20 mmol HEPES-HCl(pH 8.3),50 mmol NaCl,0.2 mM EDTA(pH 8.0)］稀释20倍，分别用PCR引物1和巢式引物1和2连续两次PCR扩增。为增加消减库的代表性，每次平行扩增四个样本，第二次PCR以第一次PCR的四个样本的混合物为模板。第一次PCR条件是75℃ 5 min ,然后94℃ 40 s，66℃ 40 s，72℃1.5 min ，32个循环；第二次PCR共17个循环，退火温度为68℃，最后72℃延伸10分钟，其它条件与第一次PCR相同。
4差异片段克隆
取3 μl第二次PCR反应产物进行T/A克隆。T-载体的制备：pBluescript SK(+)质粒经EcoR V酶切成平头后，在dTTP和Taq DNA 聚合酶存在下，在平头末端的3'-OH上加一个T。克隆后的差异表达cDNA片段即构成了消减库。
5筛选消减库
为了克服差异筛选时丢失低丰度cDNA的可能，我们用正向和反向消减的cDNA为探针进行杂交。正向消减探针与构建消减库的cDNA相同，反向消减探针则是以原来的实验者cDNA （即WKY胸腺cDNA）作为对照者，而以原来的对照者cDNA（即SHR胸腺cDNA）为实验者进行反向消减杂交后得到的cDNA。真正差异表达的cDNA克隆只与正向消减探针杂交，而与反向消减探针杂交的克隆则是背景干扰［11］。消减 cDNA探针经 RsaI、 SmaI和EagI 依次酶切，去掉了cDNA末端的衔接头，然后用随机引物标记系统（宝灵曼，德国）标上［α-32P］ dCTP。
消减库用电穿孔法转化到感受态XL1-Blue大肠杆菌，随机挑起96个克隆菌落在96孔板里培养，然后平行转移到两张同样的硝酸纤维膜上，使cDNA按照96孔板上的顺序排列。经固定后，按照Sambrook的条件［12］依次进行预杂交和杂交：在5 ml杂交液中加入50μl 20×SSC、 50 μl阻断试剂（含鲑鱼精DNA和与衔接头相同序列的寡核苷酸），杂交温度为72℃然后分别在低严谨和高严谨条件下洗膜：2×SSC/0.5 SDS,68℃，4×20 min及0.2×SSC/0.5 SDS,68℃，2×20 min。然后在-80℃放射自显影24小时。
6DNA测序和序列分析
