关键词： 高血压；胰岛素抵抗；L-精氨酸/一氧化氮系统

目的 观察胰岛素抵抗高血压大鼠血小板L-精氨酸/一氧化氮系统的改变。方法自发性高血压大鼠(SHR)自第5周至第10周喂食果糖，制备胰岛素抵抗高血压大鼠(IR)模型。在此模型上，检测血小板一氧化氮合酶(NOS) 活性、一氧化氮 (NO)产生量及L-精氨酸（L-Arg) 转运特征，同时观察了血浆L-Arg水平、心钠素（ANP）、NO水平及cGMP水平。结果SHR大鼠收缩压(SBP)(P＜0.01)，血浆ANP(P＜0.01)和cGMP(P＜0.05)水平均较WKY对照组明显升高，而血糖和血浆胰岛素水平无显著变化(P＞0.05)。IR大鼠的SBP(P＜0.01)，血浆ANP(P＜0.05)和cGMP(P＜0.05)水平较SHR进一步升高；且血糖与血浆胰岛素水平升高明显(P＜0.01)，三组间血浆L-Arg水平并无明显差异(P＞0.05)。IR大鼠血小板NO产生量 、NOS活性及血浆NO水平分别较SHR降低25%(P＜0.01)、24%(P＜0.01)和29%(P＜0.01)。L-Arg最大转运速率SHR是WKY的60%(P＜0.01)、IR又为SHR的82%(P＜0.01)，三组间米氏常数(Km)的变化无统计学意义(P＞0.05)。结论 本文结果提示NO水平降低是胰岛素抵抗高血压发病的重要基础，血小板L-Arg/NOS/NO/cGMP系统的变化在胰岛素抵抗中起重要作用。

Changes of l-Arginine /NO Pathway in Platelets in Rats with

Insulin-Resistance Hypertension

YU Wenjie²，WANG Jun³，TONG Lijia¹，YAO Xing hai¹，YU Jing³，CHANG Junhua¹，TANG Chaoshu¹

(1.Institute of Cardiovascular Research ,Beijing Medical University ,Beijing 100083; 2.Central Hospital of BYPC ,SINOPEC,Beijing 102500; 3. Beijing Military Medical College 100071)

ABSTRACT Aim To study the changes of L-arginine/nitric oxide (L-Arg/No) pathway in platelets on a rat models of fructose-induced insulin-resistance (IR)hypertension.Methods Spontaneously hypertensive rats(SHR) were fed with fructose from the fifth week to the tenth week to make IR model. On this model ,the changes of L-Arg /NO pathway in platelets were measured.Results The systemic blood pressure (SBP)、the plasma arterial natriuretic peptide(ANP) and cGMP level of SHR were significantly higher than that in normal(WKY)．No obvious difference of plasma glucose and insulin level was found between SHR and WKY. In IR model, the SBP,plasma glucose,insulin and ANP level were much higer than that in SHR(P＜0.01)．No difference of plasma L-Arg level among the three groups was found. The production of NO,the activity of NO synthase (NOS) in platelet and the plasma NO level in IR decreased by 25%(P＜0.01)，24%(P＜0.01) and 29%(P＜0.01) respectively compared with SHR .The maxium transport velocity (Vmax) of L-Arg transport in SHR were 60% of normal WKY(P＜0.01), while IR were 82% of SHR (P＜0.01). Among the three groups, no changes of Michaelis constant (Km) were found.Conclusion A decrease in plasma NO levels may be associated with IR hypertension.

KEY WORDS Essential hypertension; insulin resistance; L-Arginine/nitric oxide pathway

高血压病常伴有胰岛素抵抗（Insulin-Resistance ,IR)，表现为高血压的同时，机体各靶器官对胰岛素的反应性降低，使葡萄糖代谢障碍，出现高血糖和高胰岛素血症^［1］，其发生机理尚未完全阐明。多种体液因素如儿茶酚胺、血管紧张素，内皮素及一氧化氮(NO)等都参与了IR的发病过程。其中关于NO的作用受到高度重视。NO合成抑制可导致胰岛素的NO依赖性舒张血管作用障碍，并出现胰岛素敏感性降低，促进IR的形成^［2］。血管内皮细胞产生的NO具有舒张血管平滑肌，抑制平滑肌细胞增殖的作用； Pt 也可合成NO，具有L-Arg/NO系统，血小板源性NO能够抑制血小板的粘附与聚集作用^［3］。本文在果糖喂养高血压大鼠（SHR)复制的IR模型上，观察了IR时血小板L-Arg/NOS/NO/cGMP系统的变化与特征，以探讨血小板L-Arg/NO系统的改变在IR发病中的病理生理学意义。

MATERIALS AND METHODS

1 胰岛素抵抗高血压动物模型制备：根据Verma^［4］方法,选用4周龄雄性大鼠,分为3组:(1)对照组WKY(n=8)；(2)高血压组SHR(n=8)；(3)胰岛素抵抗组：SHR于第5周开始喂食果糖(果糖66%、脂肪12%、蛋白质22%)至第10周，经检测血浆胰岛素水平和血糖水平，符合胰岛素抵抗模型要求者用于实验(n=8)。

2 收缩压测量^［5］：间接尾带法，无外部预热，于清醒状态下测量收缩压，取连续5次读数平均值。

3血小板制备^［6］：大鼠禁食12小时，晨起6:00采静脉血(3.8%柠檬酸钠抗凝)，室温、800 rpm 离心10 min得富血小板血浆(PRP)，经4000 rpm离心15 min,得贫血小板血浆(PPP)，于ACD10%缓冲液中将PRP于3000 rpm离心10分钟，弃上清，用Ca-free Tyrode 缓冲液洗脱一次,血小板悬浮于Tyrode's 缓冲液中，调整血小板数为5×10⁸ cells/ml 。

4NOS活性测定^［6］：取血小板悬液(5×10⁷ cells)与³H-Arg (1×10⁶ cpm)用冷L-Arg稀释终浓度0.5 mmol在1.0 ml孵育液于37℃孵育30 min，用1.0 ml冷终止液终止反应，洗涤两次后，加1 ml 0.3 mmol的NCLO₄使pt破碎，再用65 μl 3 mol K₂CO₃中和，余下细胞用2.0 ml Dowex AG 50w-x8 过柱。6.0 ml 蒸馏水洗涤，液闪计数仪计数L-³H-瓜氨酸，以pmol/5×10⁷ pt 中L-瓜氨酸的形成表示NOS活性。

5 血浆和血小板亚硝酸盐测定^［6］：血小板(5×10⁷ cells /ml)与L-Arg(1.0 mmol)在1.0 ml 缓冲液中于37℃孵育1小时，4℃、3000 rpm离心15分钟终止反应，离心后收集血小板悬液，其余血小板悬液或血浆(PPP)与20 mU硝酸盐还原酶1.44 mmol NADPH，37℃孵育1小时,将硝酸盐还原成亚硝酸盐。用1.0 ml蒸馏水终止反应，随后加0.2 ml 2,3-二胺基萘(0.05 mg/ml)，在酸性条件下形成荧光产物1-氢化萘并三氮唑，孵育15分钟后，用2.8 mol的NaOH溶液100 ml终止反应，用荧光分光光度仪分别在波长365、405 nm测不同样本相对荧光强度，以硝酸钠为标准测定硝酸盐浓度。

6 血浆和血小板cGMP水平测定^［7］：取PPP 1.0 ml(5×10⁸ cells/ml )与0.5 ml三氯醋酸(TCA，终浓度10%)混合，4000 rpm离心15分钟后，上清液用H₂O-乙醚饱和液三氯醋酸提取后,用放射免疫法测定cGMP含量，结果以 pmol/5×10⁸血小板表示。

7血浆L-Arg水平测定^［6］：对去蛋白血浆样本用反向高效液相色谱(HPLC)测定血浆L-Arg水平，L-Arg滞留时间为18.8 min，健康志愿者血浆L-Arg水平为135 μmol/ L，作为外部标准，本实验CV=6.1%。

8 血小板L-Arg转运测定^［8］：取PRP 50 μl(分别加入不同浓度的³H- L-Arg(1,2,5,10,20,50,100 μmol/L)孵育1 min，加入终止液(mmol/L Formaldeyde 270,EGTA 16，NaCl 150)100 μl，经Millpore过0.45 μm孔径微孔滤膜抽滤用，用Hepes液4 ml冲洗3次，滤膜吹干加入闪烁液，液闪测³H-L-Arg放射活性，同时设立不加样本的非特异平行对照管， l-Arg的血小板转运为总摄入量与非特异结合之差。以pmol/10⁸ pt 表示。

9 血浆心房肽(ANP)、葡萄糖和胰岛素水平测定：葡萄糖氧化酶法测血浆葡萄糖，放射免疫法测血浆胰岛素和心房肽含量(放射免疫试剂盒：Amersham)，IRA敏感性为2.13±0.91 pg/ml。

10 材料：WKY和SHR 大鼠由阜外医院提供；L-³H-Arg 购自Dupont NEN，L-Arg、NADPH等购自sigma Co.；余为市售分析纯试剂，cGMP药盒购自Yamasa Shoyu 株式会社。

11统计学处理：实验结果以均数标准差表示，方差分析组间q检验作统计学处理。

RESULTS

1胰岛素抵抗高血压大鼠的一般特征 SHR 组较WKY组收缩压增加41%(P＜0.01)，血浆ANP增加52%( p ＜0.05)，血糖及血浆胰岛素水平无明显改变(P＞0.05)；IR组SBP和ANP较SHR进一步升高了7% (P＜0.01)和23%(P＜0.05) 且IR组血糖水平及血浆胰岛素水平显著升高，分别较SHR组升高11%(P＜0.05)和59%(P＜0.01)，但各组间血浆 l-Arg水平无明显差异(P＞0.05)。见Tab 1

2 血小板 L-Arg转运的动力学特征 各组大鼠Pt L-Arg 转运浓度曲线见Fig 1. Pt对³H- L-Arg呈高亲和性载体转运方式。随着L-Arg浓度的增加,血小板对L-Arg 的转运能力逐渐增强。Eadie-Hoftee plot分析，Pt L-Arg 最大转运速度(Vmax)SHR组比对照WKY组降低40%(6.29±0.70 vs 10.32±1.17，P＜0.01)，IR组又较SHR进一步降低18