第四军医大学学报2000年第21卷第5期

任崇雷刘维永张近宝晏培松

摘要: 目的探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)和活化蛋白-1 (AP-1)在风心病心肌纤维化中的作用.方法取风心病二尖瓣乳头肌,以成人及胎儿正常乳头肌为对照,以HE和Masson染色对心肌进行病理形态学观察,免疫组化染色观察TGF-β1和AP-1在心肌中的表达,用图像分析仪定量分析.结果风心病心肌间质胶原明显增生,呈网格状包绕心肌细胞,心肌内小血管内膜增生,管腔狭窄甚至闭塞. tGF-β1和AP-1在风心病及胎儿心肌中表达阳性,在正常心肌中表达弱阳性或阴性;二者在病变心肌中的表达强度均与心肌纤维化面积呈显著正相关(r分别为0.8174和0.6821, P＜0.01).结论TGF-β1和AP-1在风心病心肌纤维化中起重要作用.

关键词：风湿性心脏病；心肌；生长因子；核转录因子；胶原

0引言

转化生长因子-β1 (TGF-β1)是一种多功能的蛋白肽,是TGF-β家族中最重要的一个成员.近年研究表明, TGF-β1能增加以胶原为主的间质蛋白质的合成,在组织器官纤维化形成过程中起作用^［1,2］.而活化蛋白-1(AP-1)是TGF-β诱导的胶原激活转录的重要介导核因子,亦影响着胶原的代谢^［3］.我们应用免疫组化技术检测风湿性心脏病(风心病)乳头肌中TGF-β1及AP-1的表达,探讨二者与风湿性心脏病心肌纤维化形成的关系.

1材料和方法

1.1材料病变组标本(30例)选自我院确诊为风心病行二尖瓣替换术的左室乳头肌,除外合并主动脉瓣病变或冠心病者,其中男11例,女19例,年龄23～54岁,心功能Ⅱ级6例,Ⅲ级17例, Ⅳ级7例,病史1～30 a.术前常规行心脏彩色多普勒检查和检测心功能. 对照组5例为成年尸检标本,取自意外死亡成年正常左室乳头肌;另5例对照组为胎儿尸检标本,取自3～7月龄死胎左室乳头肌.免疫组化染色所用兔抗人TGF-β1多克隆抗体(1∶50)及c-jun/AP-1多克隆抗体(1∶400)为美国Santa cruz公司产品, 兔SP试剂盒为美国Zymed公司产品.

图1HE染色：A.风心病心肌细胞肥大或萎缩伴空泡样变性;B.血管内膜增生和管腔闭塞

fig 1A. Hypertrophy and atrophy myocytes with vacuolation; B. Lumen occlusion of small artery in myocardium of RHDHE×20

图2Masson染色：风心病心肌间质纤维增生(蓝色),呈网格状包绕心肌细胞

fig 2Significant collagen hyperplasia (blue color) which surrounded and separated the myocardium of RHDMasson stain ×10

图3病变心肌及胎儿心肌TGF-β1阳性增强,而正常心肌中阴性

fig 3Strong TGF-β1 in rheumatic and fetal myocardium, negtive in normal myocardium×20

a: Rheumatic; B: Normal; C: Fetus.

图4病变心肌及胎儿心肌AP-1表达阳性,定位于胞核(未衬染),而正常心肌中表达阴性

fig 4Positive AP-1 in rheumatic and fetal myocardium, localized in nuclear, negtive in normal myocardium×40

a: Rheumatic; B: Normal; C: Fetus.

1.2方法病变组标本在手术中取材,成年及胎儿尸检标本均在死后0.5 h内取材, 40 mL·L^-1多聚甲醛固定4～6 h,常规石蜡包埋, 连续切片厚4 μm,分别做HE、Masson及免疫组化染色.免疫组化染色经常规脱蜡至水,双氧水封闭内源性过氧化物酶,微波抗原修复,羊血清封闭,一抗孵育4℃过夜,生物素化的羊抗兔二抗工作液及辣根酶标记链霉卵白素工作液各孵育30 min, DAB显色,苏木精衬染,封片,镜下观察. 同时设有PBS阴性对照和抗流行性出血热病毒抗体替代对照.将HE, Masson及免疫组化染色切片在显微镜下随机选取5个视野,输入自动图像分析仪,定量检测心肌纤维化面积、阳性细胞数所占比例或光密度值.

统计学处理： 数据统计用SAS软件包对心肌纤维化面积和阳性表达程度进行相关性分析.

2结果

光镜观察病变心肌见间质纤维增生,呈网格状包绕心肌细胞和小血管,心内膜增厚,血管腔变窄或闭塞,心肌纤维肥大和萎缩并存,伴空泡变性(Fig1, 2). 免疫组化检测显示, TGF-β1, AP-1在风心病及胎儿乳头肌均呈阳性表达,正常成人心肌组织中表达阴性或弱阳性(Fig3, 4). TGF-β1阳性表达定位于心肌细胞、成纤维细胞胞质及部分血管内皮细胞, aP-1阳性表达定位于成纤维细胞、血管内皮细胞及部分心肌细胞的细胞核内,二者在肥大的心肌细胞及间质纤维增生活跃区阳性表达均明显增强,与心肌纤维化程度呈明显正相关(r分别为0.8174和0.6821, p＜0.01),与心功能分级呈正相关(r分别为0.7433和0.6130, P＜0.01).

3讨论

从本组病变心肌组织显微结构变化揭示,胶原成分异常沉积所致心肌纤维化是风心病心肌的主要病理改变之一,心肌间质胶原纤维增生不仅呈网格状包绕肌束和心肌细胞,并可直接影响到心脏传导和收缩功能^［4］,严重增生区内的小血管壁亦增厚,甚至造成管腔闭塞.心肌细胞被增生纤维包绕区以萎缩为主,并伴有空泡样变性,可能为缺血和退行性变引起;而且萎缩心肌细胞在以二尖瓣口狭窄为主病例多于以关闭不全为主的病例,从血流动力学方面分析可能是由于左室容量负荷较轻有关^［5］.因此慢性风湿性瓣膜病心肌病变除与风湿性心肌炎有关外^［6］,瓣膜病变造成的血液动力学变化无疑也是一个重要影响因素,心肌中小冠状动脉内膜增生管腔狭窄甚至闭塞引起的心肌缺血也可能是心肌细胞萎缩、空泡样变性以及胶原退行性变的不可忽视因素.所以风湿性心肌纤维化的病理机制远较单纯左心容量负荷型、阻力型或缺血型者复杂,心肌纤维化直接影响着心脏功能及术后疗效.

近年来生长因子的研究进展在组织纤维化方面带来新的分子水平的理解,众多细胞生长因子在胶原基因表达调控中起重要作用.其中, TGF-β1作为一个关键的生长因子,在转录水平、转录后水平及翻译水平增加胶原等间质蛋白质的合成,同时可通过抑制胶原酶等金属蛋白酶的分泌及刺激金属蛋白酶抑制剂的表达而抑制胶原的降解,从而在组织纤维化形成过程中起作用^［7］.本实验在风心病乳头肌中检测TGF-β1发现在病变心肌细胞胞质中成阳性表达,肥大心肌细胞内表达阳性增强,胎儿心肌细胞质中亦呈明显阳性表达,而在正常成人对照组心肌细胞中则为阴性或弱阳性,提示其不仅调节成纤维细胞对胶原的合成,同时还可能影响心肌细胞蛋白质的合成,调节心肌细胞由收缩型向合成型转换,参与Ⅰ,Ⅲ型胶原的合成,在心肌纤维化心肌重构过程中起了作用,并部分解释了心肌细胞参与胶原合成的机制^［8］.关于AP-1在本实验中于病变心肌中亦呈明显阳性表达定位于成纤维细胞和心肌细胞核内. chung等^［3］报道AP-1是TGF-β诱导胶原激活转录的重要介导核因子,其在成纤维细胞中与一定的碱基对序列结合而介导了TGF-β对α₂(I)前胶原促进子活性的上调作用.本实验发现AP-1在肥大心肌细胞核内阳性表达上调,指示AP-1在细胞核水平亦对TGF-β促进心肌细胞合成胶原蛋白起了作用.所以通过下调TGF-β和AP-1可能为抑制或逆转风湿性胶原纤维增生展示了一个值得进一步探讨的新路子.

基金项目:国家自然科学基金资助项目（39870790)

作者简介:任崇雷（1970-）, 男（汉族），山东省鄄城县人. 现工作在解放军第466医院胸心外科Email. chongleir@china.com任崇雷（第四军医大学西京医院心血管外科中心)

刘维永（第四军医大学西京医院心血管外科中心)

张近宝（第四军医大学西京医院心血管外科中心)

晏培松（第四军医大学西京医院病理科,陕西 西安 710033）

参考文献：

［1］ villarael FJ, Dilimann WH. Cardiac hypertrophy - induced changes in mRNA levels for TGF-β1, fibronectin, and collagen ［J］. Am J Physiol, 1992;262(6):H1861-H1866.

［2］ Li TM, Brooks G. Differential protein expression and subcel-lular distribution of transforming growth factor-β₁, β₂ and β₃ in cardiomyocytes during pressure overload-induced hypertrophy ［J］. J Mol cell Cardiol, 1997; 29(8):2213-2218.

［3］ Chung KY, Agarwal A, Uitto<