摘要: 目的: 探讨SD大鼠颈动脉窦(CS)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)与压力感受性反射(BR)及血压的关系。 方法: 合成的iNOS反义寡核苷酸(ASODN)和其正义链干预SD大鼠CS前后, 用生理记录仪同时记录血压和心率, 测定静脉注射苯肾上腺素(PE)引起的加压反应和压力感受性反射敏感度(BRS)及心率变化中点对应的血压值(MAP₅₀)，CS处iNOS含量的变化通过免疫组化的方法测定,并对其CS的 iNOS进行免疫组化染色分析。 结果:①iNOS-ASODN 干预大鼠CS后, 加压反应较干预前减弱(24±3 vs 44±6 mm Hg, P＜0.01,1 mmHg=0.133 kPa), 而iNOS正义链干预CS后加压反应较干预前无变化(37±9 vs 41±7 mm Hg, P＞0.05);②iNOS-ASODN干预大鼠CS后, MAP₅₀较干预前下降(135±6 vs 147±6 mm Hg, P＜0.01), 压力心率曲线左移, 而iNOS正义链干预CS后, MAP₅₀较干预前无差异(147±7 vs 146±7 mm Hg, P＞0.05);③iNOS-ASODN干预 大鼠CS后, BRS较干预前升高(-3.6±0.5 vs -2.3±0.7 beat^．s^-1．mm Hg^-1, P＜0.01), 而iNOS正义链干预CS后BRS较干预前无变化(-2.5±0.5 vs -2.5±0.6 beat^．s^-1．mm Hg^-1, P＞0.05); ④iNOS-ASODN干预大鼠CS后, 对血压无影响(123±6 vs 121±4 mm Hg, P＞0.05), iNOS正义链干预CS后对血压无影响(118±2 vs 121±5 mm Hg, P＞0.05);⑤iNOS-ASODN干预大鼠CS后, CS的iNOS的免疫组化染色强度较正义链组减弱, 图象分析光密度结果相差显著(0.14±0.01 vs 0.19±0.02, P＜0.01)。结论:大鼠CS处的iNOS基因被iNOS-ASODN抑制后, CS处iNOS的含量减少, 大鼠BR功能加强, 说明iNOS及由其产生的NO对BR有抑制作用。

中图分类号：R331.32文献标识码：A

文章编号：1005-3271(2000)03-0165-04

The effect of iNOS depression of carotid sinus on baroreflex

QIAO Huai-yu, ZHAO Lian-you, YANG Xue-dong, PENG Yu-hong, XU Hai-li

（Department of Cardiology, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038,Shaanxi, China）

abstract: AIM: To investigate the relation among inducible nitric oxide synthase (iNOS) gene of SD rat's carotid sinus and baroreflex and blood pressure. METHODS: Before and after the synthetic iNOS antisense oligodeoxynucleotides (iNOS-ASODN) and it's sense chain affecting SD rat's carotid sinus, blood pressure and heart rate were adopted by 6-channals physical recorder to measure the pressor response and baroreceptor sensitivity(BRS) to phenlephrine(PE) and blood pressure to the midpoint of heart rate change(MAP₅₀), the content of iNOS of SD rat's carotid sinus was determined by immunohistochemistry.RESULTS:①After iNOS-ASODN affecting SD rat's CS, the pressor response to PE was decreased(24±3 vs 44±6 mm Hg, P＜0.01), as iNOS sense chain had no effect on pressor response to PE(37±9 vs 41±7 mm Hg, P＞0.05);②after iNOS-ASODN affecting SD rat's CS, MAP₅₀ decreased (135±6 vs 147±6 mm Hg, P＜0.01), the curve of blood pressure and heart rate shifted to left, but iNOS sense chain had no effect on MAP₅₀(147±7 vs 146±7 mm Hg, P＞0.05); ③after iNOS-ASODN affecting SD rat's CS, BRS was enhanced (-3.6±0.5 vs -2.3±0.7 beat^．s^-1．mm Hg^-1, P＜0.01), as iNOS sense chain had no effect on BRS(-2.5±0.5 vs -2.5±0.6beat^．s^-1．mm Hg^-1, P＞0.05); ④iNOS-ASODN affecting SD rat's CS had no effect on blood pressure(123±6 vs 121±4 mm Hg, P＞0.05), and iNOS sense chain also had no effect on blood pressure (118±2 vs 121±5mmHg, P＞0.05); ⑤after iNOS-ASODN affecting SD rat's CS, the stain of iNOS immunohistochemistry was weaker than sense chain group, there were obvious difference between the results of their photo density (0.14±0.01 vs 0.19±0.02, P＜0.01). CONCLUSION: After iNOS-ASODN affecting SD rat's CS, the concentration of iNOS decreased, the function of BR was enhanced. It implied that iNOS and it's producing NO of carotid sinus has a negative effect on BR.

Key words:inducible nitric oxide synthase; antisense oligodeoxynucleotides; baroreflex; carotid sinus

压力感受性反射(BR)是高血压病发生的一个重要的原因, 有学者认为一氧化氮(NO)缺陷后, 先使BR受损, 而后致血压的慢性升高, 最终形成高血压^［1］。亦有人认为NO有抑制BR的作用^［2～4］。这可能与各实验用的是非特异性一氧化氮合酶(NOS)的抑制剂(L-NAME,L-NNA,L-NMMA), 且对动物多是全身用药, 缺乏对各型NOS作用的特异性有关, 从而导致研究结果不一致。本实验观察了大鼠颈动脉窦(CS)处的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因被其反义寡核苷酸(iNOS-ASODN)抑制后, CS处iNOS 及BR和血压的变化, 旨在探讨CS处iNOS对BR和血压的作用。

1材料和方法

1.1iNOS-ASODN的构建iNOS-ASODN序列为(5'-3')AGC CAT GTC TGT GAC TTT GTG (genebank No.D14051)^［5］, 同时构建其正义链, 序列为 (5'-3')CAC AAA GTC ACA GAC ATG GCT, 由BLAST软件确定序列的特异性, 序列由上海生物工程公司合成, PAGE 纯化, 纯度大于99%。 iNOS-ASODN和其正义链由Pluronic(Sigma产,上海华舜分装) 溶液溶解, 浓度为1 g/L, 保存于4℃^［6］。

1.2动物的选择SD大鼠本校动物中心供应, 共24只, 体重250～300 g, 随机分为两组：对照组(两侧CS给予iNOS正义链)、实验组(两侧CS给予iNOS-ASODN), 每组12只, 雌雄各6只。动物在18～24℃饲养，普通饮食，随意饮水，每天保持12 h的光照。

1.3基础血压和心率(HR)的测定动物用戊巴比妥(40 mg/kg, 广州精细化工厂产)麻醉, 仰卧位固定, 股动脉插管, 将压力头连接于Hellige六导生理记录仪, 滤波后记录血压信号。将四个电极连接于大鼠的四肢, 同时记录心电信号, 计算HR。血压和心电信号的记录于大鼠股动、静脉结扎3 h后在麻醉状态下进行。

1.4压力感受性反射敏感度(BRS)和加压反应的测定股静脉插管, 匀速缓慢给入苯肾上腺素(PE, 上海禾丰制药有限公司, 8～12 μg*kg^-1*min^-1), 平均动脉压(MAP)升高1～2 mm Hg/s, 同时记录HR, 每2 s采样一次^［12］, 观察HR随血压变动的情况, 由Logstic方程计算BRS^［1］。HR=A/{1+exp［B(MAP-C)］}+D, BRS=-A(B/4), 其中A为HR变化的范围, B为斜率相关系数, C为HR变化中点对应的血压值（MAP₅₀）, D为最小的HR值，同时获得PE的加压反应值。

1.5CS的处理颈部正中切口, 长度3 cm, 分离肌肉, 暴露CS, 在CS的起始处, 每侧用微量注射器在外膜下局部注射溶液2 μl以上, Pluronic溶液在39℃下,可在局部形成一固态包裹层^［6］, 防止液体扩散。处理后, 将动物放回鼠笼, 7 d后, 再次在麻醉状态下, 用1.4的方法测定血压，BRS，MAP₅₀、加压反应等值。

1.6免疫组织化学测得iNOS-ASODN及其正义链对血压和BR的影响后，经SD大鼠左心室灌注PBS(pH 7.4)100 ml, 取出两侧CS。OCT包埋, 液氮速冻后, 做连续冰冻切片, 厚度5 μm。用多聚赖氨酸(Sigma产，洛阳SABC公司分装)处理的玻片贴片, 室温下用风扇吹干, 纯丙酮固定20 min。3 ml/L H₂O₂甲醇溶液20 min, 山羊血清封闭40 min。加入1∶100的兔抗大鼠iNOS 抗体(Sigma产,武汉博士德分装), 4℃过夜。生物素标记的羊抗兔抗体(武汉博士德),室温2 h。ABC复合物室温2 h。DAB显色。封片观察。

1.7图象分析实验组和对照组各取6只大鼠（雌雄各3只），每只大鼠两侧CS各取4张切片，每两张切片相距150 μm, 进行图象分析。采用真彩色图象分析系统 CMIAS(北京航空航天大学和空军总医院共同研制)对免疫组化染色切片进行图象光密度的分析。

1.8统计学处理各组之间进行t检验。

2结果

2.1对加压反应的影响iNOS-ASODN干预 CS 后,加压反应与干预前的加压反应比较有显著差异(P＜0.01)； iNOS正义链干预CS后的加压反应与干预前比较无统计学差异(P＞0.05),见表1。

2.2对MAP₅₀的影响iNOS-ASODN干预SD大鼠CS后, MAP₅₀值较干预前下降（P＜0.01），压力HR曲线左移；iNOS正义链干预后的MAP₅₀与干预前比较无统计学差异（P＞0.05）,见表1。

2.3对BRS的影响iNOS-ASODN干预SD大鼠CS后, BRS值较干预前升高（P＜0.01）； iNOS正义链干预后的BRS与干预前比较无统计学的差异（P＞0.05）,表1。

表 1干预SD大鼠颈动脉窦前后的血压和压力反射