摘要： 目的：探讨精氨酸加压素（AVP）对大鼠心脏成纤维细胞（CFs）胶原合成的影响。方法：采用胰酶消化法分离、培养新生SD大鼠CFs，³H-脯氨酸掺入法和羟脯氨酸比色法分别观察不同浓度AVP及其V₁受体拮抗剂［d(CH₂)₅Tyr²(Me)］AVP对CFs的影响。结果：① CFs ³H-脯氨酸掺入率随着AVP浓度的增加而增高，其中10^-7mol/L,10^-6mol/L AVP组的³H-脯氨酸掺入率分别为（541±96）cpm/5000 cells和（565±72）cpm/5000 cells，较对照组（166±31）cpm/5000 cells明显增高（均P＜0.01）；10^-7mol/L AVP+10^-7mol/L［d(CH₂)₅Tyr²(Me)］AVP组³H-脯氨酸掺入率（268±64）cpm/5000 cells较10^-7mol/L AVP组明显降低（P＜0.01）。②CFs培养上清光吸收值（A值）随着AVP浓度的增加而增高，其中10^-7mol/L,10^-6mol/L AVP组的培养上清A值分别为0.22±0.01和0.24±0.01，明显高于对照组0.20±0.01，有统计学意义（均P＜0.01）；10^-7mol/L AVP+10^-7mol/L［d(CH₂)₅Tyr²(Me)］AVP组的A值为0.19±0.01，明显低于 10^-7mol/L AVP组（P＜0.01）。结论：AVP促进SD大鼠CFs胶原合成，其作用可能与V₁受体介导有关。

中图分类号：R329.28文献标识码：A

文章编号：1005-3271(2000)03-0169-03

Effects of arginine vasopressin on collagen synthesis in rat cardiac fibroblasts

YANG Xue-dong，ZHAO Lian-you, LI Xue, XU Hai-li, QIAO Huai-yu, PENG Yu-hong, CHEN Yong- qing, FAN Yan-hong

（Department of Cardiology, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi`an 710038, Shaanxi, China）

abstract： AIM: Arginine vasopressin(AVP) modulate cardiac fibroblasts(CFs) collagen synthesis was tested. METHODS: CFs of neonatal SD rat were isolated by trypsin digestion method and growth-arrested CFs were stimulated with 25 ml/L fetal calf serum in the presence of varying concentrations of AVP and 10^-7mol/L V1 receptor antagonist ［d(CH₂)₅Tyr²(Me)］AVP. Collagen synthesis was measured by ³H-proline incorporation. Collagen content of CFs culture medium was estimated by hydroxyproline chromatogragy. RESULTS: ①AVP increases ³H-proline incorporation in CFs in a concentration-dependent manner. ³H-proline incorporation value of 10^-7mol/L and 10^-6 mol/L AVP group(541±96 cpm/5000 cells, 565±72 cpm/5000 cells, respectively) were higher than that of control group(both P＜0.01). ³H-proline incorporation value of 10^-7mol/L AVP+10^-7mol/L ［d(CH₂)₅Tyr²(Me)］AVP group(268±64 cpm/5000 cells) was lower than that of 10^-7mol/L AVP group(P＜0.01). ②AVP increases A value of CFs culture medium in a concentration-dependent manner. A value of 10^-7mol/L and 10^-6mol/L AVP group (0.22±0.01, 0.24±0.01, respectively) were higher than that of control group 0.20±0.01 (both P＜0.01). A value of 10^-7mol/L AVP+10^-7mol/L ［d(CH₂)₅Tyr²(Me)］AVP group(0.19±0.01) were lower than that of 10^-7mol/L AVP group(P＜0.01). CONCLUSION: AVP increases collagen synthesis in rat CFs, which seems to be mediated through V₁ receptor.

Keywords:arginine vasopressin; collagen synthesis; cardiac fibroblasts; rat

众多资料表明，心肌纤维化参与了高血压病心室重塑过程^［1］。心肌纤维化可引起心功能障碍，表现在心肌僵硬度增加、心肌缺血和室性心律失常，是导致慢性心力衰竭的一个决定因子^［2～4］。目前认为，心室负荷过重或血流动力学因素不是诱导心肌纤维化的主要因素，而体液因素在心肌纤维化发生、发展中发挥重要作用^［5］。精氨酸加压素（AVP）是下丘脑分泌的神经内分泌多肽，具有明显的升高血压、抗利尿作用，其受体广泛存在心血管系统组织细胞中。现已证实，AVP和高血压病发生、发展密切相关^［6］，但AVP是否参与诱导心肌纤维化，国内外尚无报道。作者观察了AVP对SD大鼠CFs胶原合成的影响，以探讨AVP在心肌纤维化发生、发展中的意义。

1材料和方法

1.1主要试剂精氨酸加压素（美国Peninsular Lab）；DMEM培养液（GIBCO）； 胰蛋白酶和［d(CH₂)₅Tyr²(Me)］AVP均购于美国Sigma公司；胎牛血清（浙江金华市清湖犊牛利用研究所）；³H-脯氨酸（中国原子能研究院同位素研究所）；闪烁液为18.1 mmol/L PPO和271.7 μmol/L POPOP的二甲苯溶液。

1.2CFs分离、培养和鉴定

1.2.1CFs分离和培养 在无菌条件下取下出生后2～3 d的SD大鼠（第四军医大学实验动物中心提供）的心室，剪碎，DMEM冲洗，用1.25 g/L胰酶在37℃分离细胞，每5 min收集1次细胞。1000 r/min，离心2次，每次5 min，将所得全部细胞置于含100 ml/L胎牛血清的DMEM培养液的100 ml培养瓶中，在50 ml/L CO₂，37℃孵箱中培养60～90 min，采用差速贴壁法分离CFs^［7］。CFs贴壁速度较快，倒掉细胞悬液，贴壁的细胞主要是CFs。待CFs生长接近融合时以1∶3传代。实验采用3～4代CFs。

1.2.2CFs的鉴定 倒置显微镜下观察：细胞呈梭形、多角形，细胞质透明，细胞核明显大，呈椭圆形，常含有2～3个核。SABC法免疫组织化学染色：纤维连接蛋白染色阳性，血管平滑肌肌动蛋白染色阴性，符合成纤维细胞染色特征。

1.3CFs ³H-脯氨酸掺入的测定取对数生长期的CFs，2.5 g/L胰酶消化，用含100 ml/L胎牛血清的DMEM调节细胞悬液浓度为2.5×10⁴个/ml，加入96孔培养板中，每孔加入200 μl，静置培养至细胞接近融合。弃上清，加入无血清DMEM，继续培养24 h，使细胞维持生长静止状态。分别加入0，10^-9,10^-8,10^-7,10^-6mol/L AVP和10^-7mol/L AVP+10^-7mol/L ［d(CH₂)₅Tyr²(Me)］AVP。培养48h后加入³H-脯氨酸92.5 MBq/L和维生素C 50 mg/L, 4 h后用2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞呈细胞悬液，多头细胞收集器收集细胞至玻璃纤维滤纸上，烤干。将玻璃纤维滤纸置于闪烁计数管中，每管加入闪烁液0.5 ml，用液态闪烁计数仪测定放射性。

1.4CFs培养上清胶原含量的测定以羟脯氨酸比色法测定CFs培养上清胶原含量^［8］。将对数生长期的CFs用2.5 g/L胰蛋白酶消化，用含100 ml/L胎牛血清的DMEM培养液调整细胞浓度为2.5×10⁴个/ml，加入96孔培养板，每孔200 μl，静置培养至细胞接近融合。加入条件培养液干预同1.3。48 h后吸取培养上清50 μl，加入玻璃试管中，100℃烤干。加入50 μl 4 mol/L NaOH，轻轻震荡，在沸水中煮90 min，加入50 μl柠檬酸使pH值达6.0。加入1.0 ml氯氨T溶液，室温静置20 min。加入1.0 ml醛-过氯酸溶液，65℃水浴15 min，分光光度计在550 nm测定光吸收值A。

2结果

2.1AVP对CFs ³H-脯氨酸掺入的影响10^-9,10^-8 mol/L AVP组CFs ³H-脯氨酸掺入率分别为184±59,276±63 cpm/5000 cells，与对照组166±31 cpm/5000 cells无统计学差别（均P＞0.05），10^-7,10^-6mol/L AVP组³H-脯氨酸掺入率分别为541±96,565±72 cpm/5000 cells，明显高于对照组（均P＜0.01）。10^-7mol/L［d(CH₂)₅Tyr²(Me)］AVP+10^-7mol/L AVP组³H-脯氨酸掺入率为268±64 cpm/5000 cells，显著低于10^-7mol/L AVP组（P＜0.01, 图1）。

2.2AVP对CFs培养上清胶原含量的影响10^-9，10^-8 mol/L AVP组CFs培养上清A值分别为0.20±0.01和0.21±0.01，与对照组0.19±0.01比较无显著差异（均P＞0.05）。10^-7,10^-6mol/L AVP组分别为0.22±0.01和0.24±0.01，明显高于对照组（均P＜0.01）。10^-7mol/L ［d(CH₂)₅Tyr²(Me)］AVP+10^-7mol/L AVP组CFs培养上清A值为0.19±0.01，明显低于 10^-7mol/L AVP组（P＜0.01，图2）。

图 1［d(CH₂)₅