摘要:乙醇是心脏抑制剂,有明显的降低心肌收缩的作用。神经递质乙酰胆硷(ACh)调节心脏功能的最重要的离子通道是经鸟苷酸调节蛋白(G蛋白)的βγ亚单位而激活的毒蕈碱型钾通道(I_K,ACh)。作者采用全细胞膜片钳的方法观察了豚鼠心房肌细胞乙酰胆硷激活的钾通道及乙醇对其影响。乙醇对I_K,ACh的抑制呈剂量依赖性效应,灌注之后可使ACh激活的I_K,ACh速率减慢,峰值下降。乙醇可抑制I_K,ACh,从而影响副交感神经对心脏的调节作用。

中图分类号:Q25文献标识码:A文章编号：1005-3271(2000)01-0001-03

The effects of ethanol on acetylcholine activated potassium current of the heart

ZANG Wei-jin,YU Xiao-jiang

(Division of Cardiovascular Physiology and Pharmacology,Xi′an Medical University,Xi′an 710061，China)

ZANG Yi-min,SHANG Li-jun

(Department of Physiology,Fourth Military Medical University,China

abstract:Ethanol is a cardiac depress and it can inhibit the contraction of cardiac muscles. Acetylcholine (ACh) released from parasympathetic nerves binds to muscarinic (M₂) ACh receptor (mAChR) in the heart and this leads to the activation of muscarinic K⁺ channel via the βγ subunit of a G protein. The muscarinic K⁺ channel (I_K,ACh) in guinea-pig atrial cells and the effect of an alcohol (ethanol) on I_K,ACh were investigated using the whole-cell patch clamp technique. Ethanol depressed I_K,ACh in a dosedependent manner and ethanol slowed activation of I_K,ACh and reduced peak I_K,ACh. The decrease of I_K,ACh by ethanol may impair parasympathetic control of the heart.

Key words:alcohol, ethyl;heart;ion channels;acetylcholine

乙醇(alcohol,ethanol)的消耗使用是世界性的,它是心脏抑制剂,有明显的降低心肌收缩的作用^［1］。高浓度的乙醇可以完全废除大鼠心肌的收缩力^［2］。此外,乙醇可激活骨骼肌肌质网中咖啡因引起的钙释放通道^［3］和激活克隆的脑细胞的钙激活的钾通道^［4］。其作用可能是由于促进通道的磷酸化而增加通道的活力，从而影响激素的分泌。整体内,心脏受到交感神经和副交感神经分支的支配,从而调节窦房结的自律性、冲动的传导和心房及心室的收缩。由副交感神经释放的神经递质乙酰胆硷对心脏的效应是由于开放了心肌细胞膜周围的钾通道及降低钙通道内流等所致。交感神经的作用则与之相反。近年,乙醇对中枢神经系统的神经递质所开放的离子通道及受体的影响已引起了人们的注目^［5～7］,但它们对心脏的离子通道及由神经递质激活的离子通道的研究,尚很少见报道。本实验观察了豚鼠心房肌细胞I_K,ACh电流及乙醇对其抑制效应。

1材料和方法

1.1分离单个心房肌细胞豚鼠单个心房肌细胞的分离方法及液体如作者的前文^［8］。简言之,豚鼠(雌雄不拘,200 g～250 g)击昏后取出心脏,依次用下列液体进行主动脉逆行心脏灌流:台氏液(2 min～5 min)、无钙台氏液(3 min～5 min)、含0.1 mg/ml～0.15 mg/ml的胶原酶(Yakult)和0.5 mg/ml～0.6 mg/ml BSA的无钙台氏液(5 min～8 min)、室温KB液(5 min)。在KB液中将心房肌剪成碎块并过滤。心房肌保持在KB液中至少1 h后才进行电生理实验。

1.2记录心房肌细胞I_K,ACh电流的液体成份(mmol/L)细胞外液成份为:NaCl 136.9,KCl 5.4,CaCl₂ 1.8,MgCl₂ 0.5, NaH₂PO₄ 0.33,HEPES 5.0,Glucose 5.5, pH 7.4。电极内液成份为:K aspartate 130,KCl 20,KH₂PO₄ 1,MgCl₂ 1,EGTA 5.0,Na₂ATP(Sigma) 3, GTP(Sodium Salt,Sigma) 0.1, HEPES 5.0,pH7.3。在有些实验中GTP由0.1 mmol/L GTP γS(Sigma)代替。ACh(Sigma);Ethanol(Fisons plc)。

1.3电生理实验全细胞记录实验方法同文献［8］报道。电极电阻为2 MΩ～5 MΩ。电流信号经Axon Patch 200B放大后,由记忆示波器(Tektronix500)显示,笔式记录仪(Gould2400 Series)记录,并同时记录在录像带上供回放使用。电流信号经A/D转换器(Digidata1200A),由IBM计算机采样、Pclamp6、Origin等软件进行分析和处理。

1.4统计学处理数据以均数±标准差(±s)表示,实验结果的统计学处理以配对t检验作显著性分析。

2结果

2.1豚鼠心房肌细胞乙酰胆硷激活的钾通道我们的实验已证明:当心房肌细胞外灌注ACh时,可以经毒蕈碱受体激活I_K,ACh,即外向的钾离子流,该电流在钾平衡电位处反转,I-V(电流-电压)关系呈内向整流特性^［8］。本实验采用10 μmol/L ACh,因为这个浓度可以完全激活I_K,ACh^［9］。实验如图1A所示,当细胞被钳制在-53 mV时,经细胞外灌注ACh,可以记录出外向的钾电流I_K,ACh,很快到达顶峰,然后逐渐缓慢衰减,即出现I_K,ACh的脱敏。为了找出细胞对ACh的反应从脱敏状态恢复过来的时间,以便进一步研究乙醇对I_K,ACh的影响,并观察了I_K,ACh电流的恢复情况。

图1I_K,ACh从脱敏中恢复的观察

图1显示了二帧对照和ACh灌流实验时的情况。每次ACh的灌流时间为30 s,若恢复的时间为30 s时(图1A),则不能允许脱敏完全恢复,因而继之灌流的I_K,ACh峰值比第一个要小。然而,二次灌流的间隔时间为3 min时(图1B),则可使I_K,ACh的峰值完全恢复。因而我们观察乙醇的作用时,采用的是间隔3 min依次灌注ACh的实验方法。

2.2乙醇对I_K,ACh的影响图2A是200 mmol/L的乙醇对I_K,ACh离子流影响的例子。在给第一次ACh灌流(对照)30 s之后,将200 mmol/L的乙醇加入灌流液中。在继之给ACh的多次灌流中,可见I_K,ACh的峰值逐渐减小,到达90%峰值的时间显著增加。不同浓度(10 mmol/L～200 mmol/L)的乙醇(灌注8 min～12 min)对I_K,ACh电流峰值的影响总结于图2B。

图2不同浓度乙醇对I_K,ACh电流的影响

当乙醇的浓度大于或等于30 mmol/L时,I_K,ACh的峰值以剂量依赖的方式显著下降:30,100和200 mmol/L乙醇分别抑制I_K,ACh的峰值为(21±9)%(n=6,P＜0.05),(39±11)% (n=6,P＜0.01)和(49±8)% ( n=6,P＜0.01) (图2B)。

2.3乙醇对I_K,ACh激活、峰值和脱敏的影响图3显示了200 mmol/L的乙醇对I_K,ACh的激活、峰值及脱敏影响的进一步分析的结果。

图3200 mmol/L乙醇对I_K,ACh的激活、峰值及脱敏的影响

图3的实验方式如前面所述，在给一对照灌注30 s的ACh后，将200 mmol/L乙醇加入灌注液中。图3A显示了随乙醇灌注时间的延长,I_K,ACh峰值下降的情况。图3B为使用200 mmol/L乙醇之后,达到90% I_K,ACh峰值的时间变化,在灌注200 mmol/L的乙醇6.5 min后,到达90% I_K,ACh峰值的时间明显延长了(30±9)% (n=6,P＜0.05)。图3C是200 mmol/L乙醇对ACh引起脱敏的影响(以正常对照的百分比计)。在灌注乙醇6.5 min之后,可使I_K,ACh的脱敏程度降低约(31±7)% (n=6,P＜0.05)。

3讨论

本研究的主要发现乙醇可抑制豚鼠心房肌细胞的毒蕈碱型钾通道离子流。乙醇可抑制尼古丁型(N型)ACh受体(nAChR)通道离子流,其机制可能与其与nAChR结合,阻断其通道开放时相和稳定通道长时的关闭状态等有关^［10］。曾有报道,慢性乙醇的使用可以减少心脏β-受体的数量^［11］。本实验发现,乙醇除了降低I_K,ACh的峰值之外,还可降低I_K,ACh激活的速度及I_K,ACh的脱敏。乙醇对I_K,ACh的抑制效应可能涉及mAChR,G蛋白或毒蕈碱型钾通道三个方面。

乙醇在人体血液中接近致毒的浓度为22 mmol/L(轻度),43 mmol/L(中度)和87 mmol/L(重度)^［12］。本研究发现,乙醇抑制豚鼠心房肌细胞的I_K,ACh电流呈剂量依赖效应。灌注30 m