中图分类号：R54;R454.9文献标识码：A

文章编号：1004-3934（2000）04-0211-04

Advance in Gene Therapy and it's

Implication in Cardiovascular Disease

HUA Jun-yi,ZEN Zhi

(Department of Cardiology,First Affiliated Hospital of West China University of Medical science,SichuanChegndu610041)

随着分子生物学理论和技术的进展，特别是在载体的构建、靶基因的界定和活体内基因转移技术等方面所取得的重要进展，使许多因基因结构或表达异常引起的心血管疾病利用基因治疗可获得根治。自1992年人类首次成功地应用低密度脂蛋白受体基因治疗家族性高胆固醇血症，揭开了心血管疾病基因治疗的序幕，近十年时间内，心血管疾病基因治疗取得了一系列令人瞩目的成就。本文就基因治疗方法学及其在心血管领域的应用进展作一综述。

1基因治疗方法学及进展

1.1基因治疗的概念：基因治疗指将正常和野生型的基因插入靶细胞的染色质基因组中，以补充缺失基因或置换致病基因，从而产生新的表型的一种治疗方法。基因治疗必须具备目的基因、靶细胞以及将目的基因导入靶细胞的转基因方法。同时，目的基因的表达及对此表达的调控亦是不可缺少的重要条件。基因治疗最初用于某些先天性缺陷病，然而，基因治疗方法已不仅仅局限于此，还广泛适用于艾滋病（AIDS）、恶性肿瘤、心血管病等。

1.2基因治疗的基本类型：分体内直接转基因治疗和间接的细胞介导的基因治疗2种基本类型。直接转基因治疗，又称一步法，不需要对靶细胞进行体外操纵，而是将含有目的基因的载体甚至裸露DNA直接转导入体内。目前缺点是转导效率尚不高，需一套特异性定位转导方法以免基因在体内转导过程中播散。间接法则是先从宿主体内提取靶细胞进行体外培养，并转染含有目的基因的载体如病毒，再利用遗传特性进行筛选，最后将获得外源基因的靶细胞植回体内，发挥治疗作用。转导效率较高，但需要分两步进行，又称两步法。

1.3载体的构建：虽然裸露脱氧核糖核酸（DNA）对转导心肌细胞尚有效，但对大多数其他类型细胞无效。因此，构建安全、有效的载体至关重要。逆转录病毒和腺病毒是常用的基因转导载体。前者优势在于可转染各种细胞，并能直接整合到宿主基因组中并稳定表达，缺点是宿主细胞须处于分裂期及由于启动子随机插入有激活原癌基因的可能性。腺病毒载体对分裂期和非分裂期细胞均能转导，不整合入宿主基因组中，缺点是由于转化细胞的同时也表达腺病毒结构蛋白，可招致免疫攻击而使外源基因只能短暂表达，一般仅能持续数天到数周，从而限制了反复转染的有效性。另外，某些靶细胞缺少腺病毒受体也是腺病毒载体的一个缺点^［1］。目前又构建了低免疫原性的第二代腺病毒载体及几种抑制宿主免疫的方法^［2］。

其他病毒载体如重组腺病毒相关载体，可将病毒编码的蛋白全部缺失，只保留长末端重复序列（LTR），无病原性，安全性高，应用宿主范围广泛，适用于分裂及非分裂细胞，并可整合入宿主染色体上特定位点，长期表达目的蛋白，缺点是制作复杂，可插入外源片段过小（5kb）。还有人类单纯疱疹病毒，对神经组织有特异亲和力，可插入外源片段大（40～50kb），但有较高的细胞毒性。近来构建的慢病毒载体，既能同逆转录病毒载体一样可稳定表达靶基因，又能同腺病毒载体一样可同时转导分裂期和非分裂期细胞。

脂质体介导的DNA转染相对安全，具有较低的免疫原性，载入DNA的分子大小不受限制，同时适用于分裂和非分裂细胞，制作简单，但转染效率较低，有些脂质分子对细胞有一定毒性。目前正努力研究如何提高脂质体介导的基因转移效率。有报道结合型抗E-选择素抗体脂质体对激活的内皮细胞转导效率是非激活内皮细胞的275倍^［3］。

还可利用脂质体病毒集合物构建的复合型载体，可同时兼顾脂质体的安全性和病毒载体的高效率，如Dzan等发展的融源性病毒脂质体载体利用日本血凝病毒可与细胞融合的特点，使DNA易于直接导入细胞，避免在溶酶体内降解，从而提高转导效率。

总之，一个理想的载体应该安全、有效、具有组织细胞特异的亲和力，基因在一段时间内能够有效表达并具有可控性。因而目前有学者从事发展能随意控制目的基因表达水平的载体和细胞转录特异性的载体。我们相信，理想载体的构建在基因转移领域仍将是一个研究的热点。

1.4基因转导方法学：对基因转导活体血管的研究主要集中在冠脉、颈动脉、肢体血管的转导。大多数通过导管系统行血管腔内定位导入。如双囊导管系统和改良的多孔灌注气囊导管。这种血管基因转移有以下缺点：（1）除内皮外，动脉壁其他部位如中膜、外膜的转移效率低下。若通过气囊或管内给予高压损伤内膜，提高中膜细胞的转导效率就会影响对血管反应性的研究，因为完整的内膜对正常血管功能必不可少。（2）血流稀释影响转移效率，若用双囊导管基因转移则需要阻断血流数分钟，限制了对心脑血管行此操作。（3）基因转移仅局限于一小段血管。近年来发展了血管周围基因转移法可克服以上缺点。向动脉鞘内注射含目的基因的腺病毒载体可使目的基因在动脉外膜获得表达^［4］。近年体外转基因研究显示将基因导入动脉外膜能有效改变血管反应性^［5］。这种基因转移方法可保持血管内皮完整性及转导部位较高浓度的表达载体，除血管外膜和平滑肌层外，内皮细胞也能被不同程度的转化。

国外还有学者将含有目的基因的腺病毒载体注入鼠脑脊液（CSF）中以期转化颅内血管^［6］。如将含有NOS基因的载体注入CSF中后，NOS基因可在血管外膜和管周脑脊液中表达，产生的NO可高度自由扩散，使附近脑血管扩张。将含有白介素-1（IL-1）受体拮抗蛋白基因的重组腺病毒注入CSF中，CSF和脑中IL-1受体拮抗蛋白浓度增加5～50倍，可使大脑中动脉闭塞24小时的梗塞发生率减少64%^［7］。

活体基因转移心脏被视为将来基因治疗心脏疾病的重要方法，其是将含有外源基因的重组病毒载体、脂质体或裸露DNA直接导入活体心脏内，可提高局部心肌细胞转移效率。因开胸手术法难以被广泛接受，所以可采用静脉注射法、经胸壁注射法、冠脉内灌注法、经皮导管心肌注射法。其中静脉注射法最为简便，但载体用量大，缺乏转移的定位性，主要用于基础研究。亦可以在载体中选用心肌细胞特定的启动子或心肌细胞特异性配体使外源基因局限在心肌内表达。经胸壁注射法具有操作简便，但可致心肌机械损伤的特点。冠脉注射法是用普通动脉导管将外源基因载体注入冠脉口，该法简便、可靠、无伤，但仍有一定程度的心脏外组织非特异表达。经皮导管注射法是将尖端附有针头的注射导管插入左心室壁，并注入含有外源基因的载体，也可引起一过性局部心肌炎症反应。

还有学者将腺病毒载体导入心包^［8］，导入的目的基因可表达蛋白产物释入心包液中。设想如果这种蛋白产物是一种血管内皮生长因子，心脏浸浴在这样的心包液中，就有可能促进心包脏层下心肌侧支血管形成，为活体基因转移心脏开辟了一条新途径。

近年又创建了基因缝线、基因电针、基因支架、基因气囊导管等新的直接基因转移法^［9］。

2心血管疾病基因治疗应用前景

目前心血管病基因治疗尚处于不成熟阶段。其一，相对肿瘤等其他疾病而言，心血管病的基因治疗的风险/受益比较高；其二，大多数心血管病是多基因异常，因而对导致心血管疾病的靶基因的界定较困难。但随着基因转移技术和反义技术的进步，将有更多的潜在靶基因被人们认清，相信基因治疗心血管病具有广阔前景。

2.1家族性高胆固醇血症（FH）：是人类首次将基因治疗应用于临床的成功例子。在FH动物模型中，用二步法将人低密度脂蛋白受体（LDL-R）基因导入体外培养的肝细胞，再将肝细胞回输到动物体内，可使血浆胆固醇水平显著下降^［10］。对人体用同样的方法可使血浆LDL浓度显著降低17%，并保持18个月^［11］。近年来还发展了用直接法导入目的基因来纠正动物模型的高胆固醇血症。如用腺病毒载体将含有编码人类apoAI的目的基因转导正常小鼠可增加循环中的高密度脂蛋白（HDL）^［12］，但基因表达水平迅速下降，转导12天后降至峰值的10%以下。对某些疾病而言，短暂表达可能已足以产生治疗作用，但对一些慢性疾病如高胆固醇血症，外源基因的稳定表达对发挥长期治疗作用是非常关键的。目前还界定了其他一些防治脂代谢异常的候选基因，如极低密度脂蛋白受体（VLDL-R）基因可加速肝对VLDL的摄取；胆固醇7α-羟化酶基因可将胆固醇转化为胆汁酸；载脂蛋白（apo)BEC-I基因可减少apoB 100生成，降低脂蛋白［a］（LP［a］）水平；卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）基因促进胆固醇逆向转运等。

2.2PTCA术后再狭窄及抗血管内膜增生：成功的PTCA术后冠脉再狭窄发生率约30%～50%，可能是血管重构的结果，包括平滑肌细胞激活、增生、迁移和细胞外基质合成。全身给药防治再狭窄疗效很差，因而研究重点放在对PTCA术后血管壁的局部治疗，可通过特制的导管向PTCA术后局部血管注药，将反义寡核苷酸导入局部损伤的血管，可抑制平滑肌细胞增殖，使用反义技术抑制血管内