目的：观察三维培养内皮细胞在生长因子血小板源性生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)作用下血管样结构的形成。方法： 制备三维培养胶原基质和细胞培养。结果： 对照组内皮细胞在胶的表面呈单层生长， 未见其向深层生长及管腔结构形成。 PDGF组内皮细胞在胶内呈多层浸润生长， 伸展、 变形呈扁平状； 内皮细胞与胶原纤维之间以半桥粒连接， 内皮细胞之间以桥粒连接， 形成毛在管样管腔结构， 管腔样结构大小不一， 其间有多个散在的内皮细胞； 部分内皮细胞内可见空泡样变， 边界由胞质与胞膜组成， 细胞核变形， 凹陷， 可见切迹， 或呈薄片状， 空泡样变及细胞核形态的变化在形成管状结构的内皮细胞中尤为明显； 内皮细胞管腔面及游离面内皮细胞均有微绒毛突起。结论： 三维培养技术简单易行， 是揭示在体血管形成的最简单模型； PDGF有利于三维培养内皮细胞在有展性的胶原基质面形成血管样结构。

Experimental Study of Formation of Vascular Tube in Three-Dimension Cell Culture

Xia Hao, Li Gengshan, Li Jianjun

（First Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430060）

Objective: To disclose whether platelet derived growth factor(PDGF) could facilitate the formation of vessels in 3-dimension cell culture system.Method: Endothelial cell was cultured by three dimensions system on collagen gel surface with stimulate of PDGF.Results: In PDGF groups, endothelial cell growthed by soak type, transmuted into flat cell, endothelial cell connected to collegen by hemidesmosome, endothelial cell connected each other by desmosome, forming vascular tube, size of vascular tube varied and had many cells in it, endothelial cell and nuclues changed in shape. In control groups, endothelial cell gowthed by single layer, having vascular tube.Conclusion: The technique of three dimension cell Culture is simple and practicable, which is the simplest model to disclose angiogenesis in vivo. Three dimension cell culture found PDGF could induce endothelial cell angiogenesis in vitro.

Key words: Endothelial cell; Platelet derived growth factor; Angiogenesis; Three-dimension cell culture

促进缺血组织新生血管的形成是当今治疗这类疾病的新思路， 其关键是选择一合适的促血管 形成生长因子。 传统的二维细胞培养方法可以观察生长因子对于培养内皮细胞增生、 移行 的影响， 但因其不能提供细胞生长的三维空间， 难以研究生长因子在促进培养内皮细胞形 成血管样结构中的作用， 因此对于评价生长因子的促血管再生作用有一定局限性。 三维细 胞培养方法克服了这一不足， 可使细胞呈立体生长， 而且更接近于体内环境^［1］ 。 本实验将采用三维细胞培养方法， 接种脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endoth elial cell, HUVEC)于胶原基质胶面上， 观察在血小板源性生长因子(platelet derived g rowth factor, PDGF)作用下， HUVEC在胶原中血管样结构的形成。

1材料与方法

1.1试剂

HUVEC株由武汉大学中国典型培养物保存中心提供。 Ⅰ型胶原(Collagen Type Ⅰ)购自Sigm a公司。 DMEM/F₁₂培养基、 胎牛血清(FBS)及青霉素-链霉素均为美国Bibco公司产品。 其它常用试剂为国内生产。

1.2仪器

主要实验仪器包括培养板、 直弯头玻璃吸管(国内产品)、 CO₂培养箱(美国Shel-Lab 23 00型)、 超净工作台(苏州净化设备厂)、 倒置相差显微镜(日本Olympus CK2型)、 水浴锅( 日本Shimadzu TB-85型)、 电子秤(瑞典AE200S型)、 冰箱(容声BCD-203A型)、 LKB11800 型切片机、 LKBV2088型超薄切片机、 透射电子显微镜(日本Hitachi H-600型)。

1.3实验方法

1.3.1三维培养胶原基质的制备和细胞培养^［2］

胶原存储液的配制方法是将Ⅰ型胶原溶于10 mmol的柠檬酸， 浓度1.5 mg/ml。 胶原凝 胶成分为7倍体积的胶原浓缩液(4 mg/ml)， 1倍体积的10×DMEM/F₁₂， 1倍体积的 0.1 N氢氧化钠(NaOH)和1倍体积的FBS。 取2 ml胶原溶液倒到24孔培养板中， 37℃使其 凝固， 在凝固胶原面上， 以2×104 cm²密度接种HUVEC， 置于37℃、 5% CO₂的培养 箱培养至细胞达70%～80%的融合状态。 对照组及PDGF组均换含2% FBS的培养基， PDGF组加 入浓度20 ng/ml的PDGF， 隔天换液， 1 周后显微镜镜下观察、 取材。

1.3.2电镜检查

长有细胞的胶原块用2.5%戊二醛固定2～4 h， 削成小块后， 以0.1 Mol磷酸缓冲 液浸洗3次后， 浸泡12～15 h， 取出标本， 以1%四氧化锇固定1～1.5 h， 0.1 M ol磷酸缓冲液冲洗30 min， 梯度酒精脱水(50%、 70%、 80%、 95%、 100%)二次， 每次15 min， 用水溶性包埋剂包埋， 1∶1的包埋液和酒精浸透30 min， 纯包埋液(苯二甲酸二丙 烯酯)浸透1 h， 60℃聚合72 h， 半薄切片(1 μm)后1%美兰染色， 光镜检查， 超薄切片 后， 以醋酸双氧铀—枸橼酸铅双重染色、 制片， 用透射电子显微镜观察、 照相。

2结果

2.1倒置相差显微镜观察

在胶原基质的纵断面， 对照组见HUVEC向胶内浸润， 在胶原表面呈单层生长。 PDGF组可见 HUVEC沿胶原基质向胶原内浸润生长， 并形成垂直于胶原基底面的分支样结构， 相互交织 成网(图1)。

2.2半薄切片光镜观察

垂直于培养板纵轴切片， 对照组HUVEC在胶的表面呈单层生长， 未见其向深层生长及管腔 结构形成。 PDGF组可见HUVEC在胶内细胞呈多层浸润生长； 内皮细胞伸展、 变形呈扁平状 ； 细胞之间相互连接， 形成毛细血管样管腔结构， 管腔样结构大小不一， 其间有多个散 在HUVEC(图2)。

2.3电镜观察

对照组可见生长在胶原支架上的内皮细胞， 其结构特征清晰可见， 无毛细血管样管腔结构 。 PDGF组可见HUVEC生长在胶原支架上， 并有突起伸至胶原网架中， 胶原纤维的横纹清晰 可见； 内皮细胞与胶原纤维之间以半桥粒连接， 内皮细胞之间以桥粒连接； 二个或多个 内皮细胞之间形成管腔样结构； 部分内皮细胞内可见空泡样变， 边界由胞质与胞膜组成， 细胞核变形、 凹陷， 可见切迹， 或成薄片状， 空泡样变及细胞核形态的变化在形成管 状结构的内皮细胞中尤为明显； 内皮细胞管腔面及游离面内皮细胞均有微绒毛突起(图3～5 )。

图1PDGF组内皮细胞向胶原基质内生长，可见分支样结构

2PDGF组内皮细胞呈多层浸润生长细胞生长变形，呈扁平状，形成管腔结构其间可见内皮细胞

3PDGF 组内皮细胞生长在在胶原支架上，胶原纤维横纹清晰可见

4PDGF组细胞胞间有微绒毛，细胞内有微小裂隙

5PDGF组见多个细胞形成的管腔样结构细胞间可见桥粒连接

3讨论

3.1血管再生及三维培养技术

血管再生主要有二种模式^［3］， 一是散在的内皮细胞聚集、 连接、 形成管腔； 二是由早期血管雏形出芽形成新血管， 其过程是复杂的。 1970年代以前， 人们在体外研 究内皮细胞成血管功能、 生长因子促血管形成作用时只能用传统的二维细胞培养技术， 但 其不能提供细胞生长的三维空间， 因而限制了离体血管的再生研究。 现今， 已有四种成 熟的离体血管的再生研究手段， 它们是生物相容多聚物法、 角膜微袋技术、 鸡胚绒膜尿 囊膜方法及血管内皮细胞的三维培养法^［4］。 其中， 内皮细胞的三维培养法是利 用单一离体血管内皮细胞在一定条件下形成管状结构的特点， 模拟上述的第一种血管形成 模式， 是揭示在体血管形成的最简单模型。 根据三维培养特点， 结合我们的实验目的及 现有条件， 本研究采用了三维培养技术。

内皮细胞的三维培养法在方法学上有许多差异。 可以将内皮细胞接种于胶原基质表面， 观 察其向下生长、 形成管腔样结构能力； 也可以在二层胶原基质之间接种内皮细胞， 使其 上下生长， 即所谓的“三明治法”； 还有学者将胶原溶液与内皮细胞混合后培养^［2