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Effect of Jiantaiye on Human Umbilical Vein Endothelium Cells Releasing Vascular Activity Substance
Jiang Deju, Huang Guangying, Hao Tianling
（Yongji Medical University, Wuhan 430030）
Objective: To investigate the mechanism of Jiantaiye's prevention and treatment to intrauterine growth retardation(IUGR), the effect of Jiantaiye on hypoxia cultured human umbilical vein endothelium cells(HUVEC) releasing endothelin(ET), prostacyclin(PGI2), nitric oxide(NO) and their protecting endothelium cells were studied by using the serum pharmacological method.Method: Four groups were observed. The normal group, the hypoxic group, the serum group, the Jiantaiye group. The ultrastructure of the HUVEC was observed and taken photos. The cultured juice was collected to measure ET, PGI2 and NO.Results: It was shown that Jiantaiye can significantly increase release of PGI2 and NO of HUVEC(P＜0.05～0.01). At the same time, Jiantaiye can decrease release of ET of HUVEC(P4 h＜0.05). Studying on the ultrastructure, Jiantaiye could alleviate the danger of the organelle and nucleus in hypoxia condition. The mitochondria were protected more obviously.Conclusion: One of the mechanisium of Jiantaiye's prevention and treatment to IUGR is brought out by enhancing the tolerance of endothelium cells in hypoxia state and regulating the release of endothelium factors.
Key words:Jiantaiye, Traditional Chinese Drug; Human umbilical vein endothelium cells; Endothelin; Prostacyclin; Nitric oxide
健胎液是临床长期运用防治胎儿宫内生长迟缓(Intrauterine growth retardation, IUGR)之 验方， 由黄芪、 当归、 丹参、 川芎、 桑寄生等益气活血、 补肾安胎中药组成。 前期 动物实验表明： 该方能改善IUGR孕鼠血液流变学特性， 增加胎盘组织一氧化氮的含量 ［1］； 临床研究表明： 该方能增加新生儿体重， 增加胎儿脐血氨基酸含量， 使异常 胎盘合体细胞微绒毛恢复正常， 临床疗效高于氨基酸［2］。 本研究采用血清药理 学方法［3］探讨健胎液对缺氧人脐静脉内皮细胞(HUVEC)合成分泌ET、 PGI2和NO 的影响， 观察健胎液对缺氧HUVEC形态结构上的保护作用， 从细胞水平上阐述健胎液防治I UGR和妊娠高血压综合征(妊高征， 很多IUGR源于妊高征)的机制。
1材料与方法
1.1仪器及试剂
主要仪器： CO2培养箱(Shel. Lrs Model 2300， Sheldon Manufacturing, INC. 美国) ； 倒置相差显微镜(COIC 4411， 日本)； 透射电镜(Opton, EM10C， 德国)； SN-682 型放免γ计数器(上海核福光电仪器公司)； 721型分光光度计(上海第三仪器分析厂)。
试剂： DMEM培养基、 胰酶(1∶250)均购自GIBCO公司； 小牛血清购自中国医学科学院血液 病研究所； 磺胺由浙江衢州化学试剂厂生产， 批号930624； N-1萘基乙二胺购自北京化 学试剂公司， 批号940320； NaNO2河南焦作化工三厂生产， 批号960218。
1.2实验药物
健胎液的组成： 黄芪、 当归、 川芎、 丹参、 桑寄生按一定比例制成无菌煎剂， 由同济 医院药剂科配制， 批号96072。
1.3含药兔血清的制备
参照文献［4］方法， 取健康雄性日本大白兔6只， 体重2.5～3.0 kg， 由 同济医大实验动物中心提供。 随机分成二组， 一组用于制备含药兔血清， 另一组用于制 备正常兔血清。 按体表面积折算及灌药剂量筛选结果， 健胎液给家兔灌药量为7 ml/kg*2 4 h-1， 将三只兔连续7天灌胃， 末次灌胃2 h后心脏采血， 离心取血清， 56 ℃灭 活30 min， 滤过除菌， -70 ℃保存备用。 另三只兔灌等量生理盐水， 以同样方法制备正 常兔血清。
1.4HUVEC的培养及实验分组
HUVEC购于武汉大学细胞保藏中心(ECV -304， Arcc NO CRL-1998)， 用DMEM培养基(pH= 7.2～7.4)， 含20%小牛血清， 每毫升培养液含青霉素100 U、 链霉素100 μg)， 在37 ℃ 5% CO2培养箱中培养， 待细胞完全汇合成单层后， 用0.125%胰酶(pH=7. 6， 含0.02% EDTA)消化传代， 接种于25 ml培养瓶中， 2～3×105/瓶， 3～4天 后细胞汇合成单层， 倒去培养液， 用D-Hanks液洗二遍， 随机分成四组， 每组6瓶：
A组(正常组)： 加入3 ml无酚红、 无血清的DMEM培养液， 放入5% CO2、 95% O2培 养箱37 ℃培养。
B组(缺氧组)： 加入3 ml无酚红、 无血清的DMEM培养液。
C组(缺氧+正常血清组， 简称血清组)： 加入3 ml无酚红、 含正常血清的DMEM液， 兔血清 终浓度为400 μl/ml(培养液)。
D组(缺氧+含药血清组， 简称健胎液组)： 加入3 ml无酚红、 含药兔血清的DMEM液， 含药 血清终浓度为400 μl/ml(培养液)。
B、 C、 D组通入95% N2、 5% CO2， 37 ℃培养。
1.5观测指标及方法
1.5.1透射电镜观察： 各组细胞加入各处理因素6 h后， 消化、 离心， 收集细胞， 2.5%戊二醛固定， 常规包埋、 切片， 透射电镜下观察摄像。
1.5.2标本采集及ET、 PGI2、 NO检测： 各组细胞在培养2 h、 4 h、 6 h时取培养液离心， 取上清， -70 ℃保存待测ET、 PGI2、 NO。 6-keto-PGF1 α是PGI2稳定的代谢产物， 测定6-keto-PGF1α的浓度可以反映PGI2的生成 量； 亚硝酸盐(NO-2)是NO的代谢产物， NO-2的生成量与NO的合成分泌量相平行， 测定NO-2的量可以反映NO的生成水平［5］。
ET的放免测定： 125I-ET放免药盒购自北京东亚免疫技术研究所， 批内变异CV ＜10%， 批间变异CV＜15%， 本抗体与α-人心钠素、 降钙素基因相关肽血管紧张素Ⅰ、 Ⅱ 以及舒血管肠肽(VIP)等均无交叉反应， 由同济医院核医学科用SN-682型放免γ计数器测 定。6-keto-PGF1α放免测定： 125I-6-keto-PGF1α放免药盒购 自北京东亚免疫技术研究所， 批内变异系数CV＜3.5%， 批间变异系数CV＜10%， 对其它 花生四烯酸代谢产物交叉反应＜0.1%， 由同济医院核医学科测定。 NO-2测定： 取800 μl培养细胞上清液， 加入等量Griess反应液(5% h3PO4、 1% 磺胺、 0.1% N-1萘基乙二胺)， 室温静置10 min， 在550 nm处读取数值，以NaNO 2作标准品， NO-2浓度单位为μmol/L。
1.6统计学处理
采用SAS软件包进行t检验， P＜0.25表示有差异， P＜0.05表示差异有 显著性， P＜0.01表示差异有极显著性。2结果
2.1透射电镜观察结果
正常组细胞线粒体、 内质网、 细胞核清晰可见， 有少量小空泡， 突起多， 核糖体多分 布于内质网附近， 有些细胞可见膜包被的杆状Weibel-Palade小体(图1)； 缺氧组细胞线 粒体严重肿胀呈球形， 有大量大空泡， 胞浆疏松， 内质网扩张， 突起很少或没有， 少 数细胞核碎裂(图2、 3)； 血清组线粒体肿胀程度略轻于缺氧组(图4)； 健胎液组线粒体不 肿胀， 或极少数轻度肿胀， 内质网和细胞核正常， 有少量小空泡， 突起正常(图5)。
