目的: 探讨肝脏缺血再灌注过程中肝微循环变化及其在再灌注损伤中的作用。 方法: 采用大鼠缺血再灌注模型, 按肝血流阻断时间将260只大鼠分为假手术对照组、 阻断20、 40、 60和90 min组; 观察各组动物的存活和血清转氨酶的变化, 测定各组动物在血流阻断期末、 开放2 h时的肝坏死范围, 肝门静脉恒压灌流量和肝血窦超微结构的变化。 结果: 各阻断组动物死亡率分别为5%、 10%、 85%和95%; 术后2天内死亡率最高, 伴随血清转氨酶明显上升。 血流阻断20、 40、 60和90 min组再开放2 h, 肝总坏死范围分别为3.9%、 13.5%、 66.4%和82.7%, 其中肝血流开放后的肝坏死范围分别占肝总坏死范围的7.7%、 11.1%、 68.1%和67.2%; 肝门静脉恒压灌流量于阻断期末分别下降5.3%、 14.7%、 44.1%和56.5%; 肝血窦在阻断20、 40 min组无阻塞现象, 阻断60和90 min组出现血细胞, 膜浆泡和纤维束积滞, 阻塞血窦面积占肝血窦总面积的50%。 结论: 肝血流阻断后肝损伤不仅发生在缺血期, 更重要的是发生在再灌注时; 再灌注损伤的发生与缺血时间长短、 肝微循环再灌注障碍有关。

Liver Ischemia Reperfusion Injury and Changes of Liver Microcirculation

Xiong Chenglong, He Jie, Wu Shanmin, et al

First Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430060

Objective: To assess the relationship between liver ischemia-reperfusion injury and the changes of liver microcirculation. Methods: A model of normothermic hepatic blood flow clamping and declamping in rat was adopted. The animals survived, alamine aminotransferase serum(SALT) level, extent of hepatic necrosis, liver volume of blood flow and ultrastructure of liver sinusoids during various periods of ischemia and reperfusion were observed comparatively. Results: The mortality in group of false operation, ischemia for 20, 40, 60 and 90 minutes was 0%, 5%, 10%, 85% and 95% respectively; and animals died with a high SALT level. After 20, 40, 60 or 90 minutes ischemia and 120 minutes reperfusion, the ratio of necrotic to no-necrotic liver were 3.9%, 13.5%, 66.4% or 82.7%, of those the percentage necrosis during reperfusion 120 minutes was 7.7%, 11.1%, 68.1% or 67.2% respectively; The liver volume of blood flow decreased to 94.7%, 85.3%, 55.9% or 43.5% of normal values in end of ischemia; Liver sinusoidal obstruction by blebs originating from the hepatocytes, fragments of sinusoidal endothelial cell damage and aggregation of blood cells was observed in group of 60, 90 minutes ischemia. Conclusions: Liver ischemia can result in cellular injury from ischemia itself, but an addition component of injury results from events occurring during reperfusion after lengthening of the ischemia, and show that reperfusion injury was attributed to the microcirculatory disturbance, decreasing liver blood flow, increasing rapidly the degree of irreversible damage and mortality.

Key words: Microcirculation; Ischemia reperfusion; Liver; Rat

肝脏缺血再灌注见于许多临床疾病和手术过程中。 肝缺血再灌注时, 肝脏组织细胞发生一系列代谢、 结构和功能的损伤, 甚至导致肝功能衰竭, 是影响疾病预后、 手术成败和病人存活的主要因素之一。 因此研究肝缺血再灌注损伤和防治具有重要的临床意义。 目前有关常温肝缺血再灌注损伤与肝微循环变化的关系有待研究, 本实验对此进行初步观察, 为防治肝缺血再灌注损伤提供理论依据。

1材料与方法

1.1动物模型与分组

健康Wistar大鼠, 雌雄兼用, 体重200～250 g。 禁食12 h后, 腹腔注射3%戊巴比妥钠300 mg/kg(体重)施行麻醉。 上腹正中切口进腹, 分离切断肝脏周围诸韧带, 解剖肝门。 按大鼠肝脏分叶, 用小号无损伤动脉夹选择性阻断肝脏左、 中叶肝蒂(包括肝动脉、 门静脉和胆管); 保留余肝叶血流, 避免门静脉系统瘀血。 阻断一定时间后, 放开动脉夹, 恢复阻断肝叶的血供; 同时结扎未阻断肝叶肝蒂, 防止其盗流发生, 造成部分肝脏(70%)缺血再灌注模型^［1］。 根据不同的肝血流阻断时间, 将260只大鼠随机分成五组: 假手术对照组(肝血流阻断后立即开放), 阻断20、 40、 60和90 min组。 假手术对照组20只动物, 各阻断组均为60只动物。

1.2观察项目与方法

死亡率: 每组随机选择20只大鼠, 手术完毕后关闭腹腔, 待动物苏醒后, 自由进食饮水, 喂养7天, 临床观察计算死亡率。

血清转氨酶测定: 对进行死亡率观察的动物, 于术前、 术后2 h和术后1、 2、 4、 7天, 经尾静脉采集血样, 按Reitman法测定血清谷丙转氨酶(ALT)水平。

肝门静脉恒压灌流量测定: 假手术对照组、 各阻断组于血流阻断期末和开放后2 h分别随机选择20只动物, 行门静脉插管, 结扎肝上、 肝下下腔静脉并切断肝下下腔静脉; 用稀释血液作门静脉灌流, 调定灌流压为0.98 kPa, 记录灌流量^［2］。

肝坏死范围测量: 在行肝门静脉灌流量测定后, 假手术对照组、 各阻断组于血流阻断期末和开放后2 h分别随机选择15只动物, 将阻断肝叶横行切成厚1 cm的片块状, 置于25 ℃的硝基四氮唑蓝液中孵育20 min; 按未染色的区域作为坏死肝组织计算肝脏坏死范围(即占缺血肝叶组织的百分率)^［3］; 开放后2 h所测定的肝坏死范围为肝总坏死范围。

肝血窦超微结构观察: 在行肝门静脉灌流量测定后, 假手术对照组、 各阻断组于血流阻断期末和开放后2 h分别随机选择5只动物, 用2.5%戊二醛作肝脏灌注固定; 将固定的肝左、 中叶切成50～70块, 随机选择5块行锇酸后固定, 单宁酸导电染色, 液氮冷冻割断, 临界点干燥; 样品喷金后用日立S520型扫描电子显微镜观察。

1.3实验数据统计学处理

实验所得统计量用率或平均数±标准差表达, 率或平均数的差异显著性检验分别采取U检验法或t检验法。

2结果

2.1动物存活情况

假手术对照组无动物死亡。 血流阻断20、 40、 60和90 min组术后7天动物死亡率分别为5%、 10%、 85%和95%(图1)。 各阻断组动物均以术后2天内死亡率最高。 术后7天, 阻断40 min组有18只(90%)动物存活, 而阻断60 min组仅有2只(15%)动物存活, 二者差异有显著性意义(P＜0.05)。

2.2血清转氨酶水平变化

各组分别对3～20只动物行血清ALT测定。 ALT水平于肝血流阻断后2 h明显上升, 24 h达高峰, 然后渐渐下降至正常水平。 死亡动物血清ALT水平明显升高。 各组动物术后24 h血清ALT水平分别为110、 160、 180、 380和490 U/L(图1), 阻断40 min组明显低于阻断60 min组(P＜0.05)。

2.3肝脏大体观察

正常大鼠肝表面色泽红润, 阻断肝血流后, 颜色变成暗红色; 随阻断时间延长, 渐渐变成浅灰色, 质地变软。

阻断20 min组血流开放后, 肝表面颜色很快恢复正常, 未见肝脏肿胀; 阻断40 min组复流后, 肝表面呈现少量点状无复流区域; 阻断60 min组复流后, 无复流区域增多、 增大, 使肝表面呈现花斑状, 随复流时间延长, 有些无复流区进一步扩大, 有些则缩小、 消失。 阻断90 min组复流后, 肝表面呈灰红相间的斑块状。

2.4肝门静脉恒压灌流量变化

阻断20、 40 min组于阻断期末灌流量无明显下降, 分别为正常组的94.7%和85.3%, 血流开放2 h后仍保持91.2%和80.4%; 而阻断60、 90 min组于阻断期末灌流量明显下降, 分别为假手术对照组的55.9%、 43.5%, 开放血流后2 h仍继续下降, 分别为41.7%、 32.8%(图2), 与阻断20、 40 min组比较有极显著性差异(P＜0.01)。

2.5肝坏死范围变化

假手术对照组坏死范围为0.8%。 阻断20、 40、 60和90 min组在阻断期末, 肝坏死范围分别为3.6%、 12.1%、 21.2%和27.1%。 各阻断组血流开放后2 h肝总坏死范围分别为3.9%、 13.5%、 66.4%和82.7%; 由此推算其中的再灌注期间肝坏死范围分别占肝总坏死范围的7.7%、 11.1%、 68.1%和67.2%, 阻断血流40 min组明显小于阻断60 min组(P＜0.05), 见图1、 2。

1大鼠术后7天死亡率、 24 h血清ALT水平和

2h肝总坏死范围的变化

2大鼠肝血流阻断、 开放期肝坏死范围

和门静脉灌流量的变化