摘要

目的：构建成人动脉和心脏互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库，克隆多个新的全长互补脱氧核糖核酸(cDNAs)。

方法：应用成人动脉和心脏组织，采用Stratagene的建库试剂盒构建cDNA文库。将随机克隆5'端表达序列标签序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库进行同源性比较，新的全长cDNAs采用步移法完成全序列测定获得。

结果：所建动脉cDNA文库包含2.4×10⁶个独立重组克隆，插入片段平均长度为2.0kb；心脏cDNA文库包含1.0×10⁶个独立重组克隆，平均长度为1.8kb。首批得到了8条新的全长cDNAs，已在GenBank登记注册。

结论：构建符合要求的cDNA文库是克隆新的全长cDNAs的一条快速有效的途径。

中图分类号：Q343文献标识码：A文章编号：1000-3614（1999）06-0369-03

Construction of Human Adult Artery and Heart cDNA Libraries and

Cloning of Novel Full-Length cDNAs

Wei Yingjie,Ding Jinfeng,Zhao Yong,et al.

Molecular Medicine Center,Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital,CAMS and PUMC,Beijing(100037)

Abstract

Objective:Construction of human adult artery and heart complementary deoxyribornucleic acid (cDNA)libraries and cloning of novel full-length cDNAs from the cDNA libraries.

Methods:Construct cDNA libraries using Stratagene Kit,human adult artery and heart samples.5'partial sequnces (namely expressed sequence tags,ESTs)of randomly picked clones were sequenced and compared to all known sequences in the GenBank/EMBL/DDBJ databases.Novel full-length cDNAs with putative important functions were obtained by walk sequencing.

Results:The human adult artery cDNA library consists of 2.4×10⁶ clones with the average length of 2.0 kb and the heart cDNA library consists of 1×10⁶ clones with the average length of 1.8 kb).Eight novel full-length cDNAs with putative important functions were registered in GenBank database.

Conclusion:The availability of high quality cDNA libraries is a rapid and efficient approach to find novel full-length cDNAs.

Key wordsArteries;Heart;Gene library;Expressed sequence tags;DNA,comple mentary

(Chinese Circulation Journal,1999，14：369.)

人体不同细胞表达基因的不同决定了其组织和器官表现型的差异。在心血管系统中，有哪些基因参与了生长、分化和功能调节乃至心血管疾病的发生?这些都是亟待解决的问题。在这方面的研究中，互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库是克隆多个新的全长互补脱氧核糖核酸(cDNAs)或疾病相关基因的有用工具。本研究应用成人动脉和心脏组织，构建了符合要求的cDNA文库。并克隆得到了8条新全长cDNAs。现已开始其表达谱及功能的研究。

1材料和方法

cDNA文库的构建总核糖核酸(RNA)的提取和信使核糖核酸(mRNA)的分离：采用Promega公司(美国)的“RNAgents Total RNA Isolation System”试剂盒提取总RNA。再用Pharmacia公司(瑞典)的“mRNA Purification Kit”分离mRNA。

第一链cDNA的合成：在无RNA酶的0.5ml离心管中依次加入：5μl 10×第一链缓冲液，3μl甲基化的三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)混合物，2 μl Xho I-adaptor oligo(dT)₁₈引物(1.4 μg/μl)；32.5 μl DEPC水，1 μl RNA酶抑制剂(40U/μl)，混匀，加入5μg mRNA，混匀，室温置10min，加入1.5μl莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶(50U/μl)，终体积为50μl，混匀，从中取出5 μl转入另一管，并加入0.5 μl ［α-³²P］三磷酸脱氧腺苷(dATP)(800 Ci/mmol)，以鉴定第一链合成质量。上述两管均在37℃孵育1h。

第二链cDNA的合成和EcoR I-adaptor的连接：在灭菌的0.5ml离心管中依次加入：45μl第一链cDNA；20μl 10×第二链缓冲液，6μl dNTP混合物；114μl蒸馏水，2μl ［α-³²P］dATP(800 Ci/mmol)，2 μl RNA酶H(1.5U/μl)，11μl脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶I(9.0U/μl)，混匀后16℃孵育2.5h。反应结束后加入23μl dNTP混合物和2 μl Pfu DNA聚合酶(2.5U/μl)，72℃孵育30min，以补平cDNA末端。反应结束后采用酚∶氯仿(1∶1)抽提和乙醇沉淀的方法，得到第二链cDNA沉淀，加入9μl EcoR I-adaptor溶解沉淀，并取出1μl与第一链cDNA一起进行碱变性胶电泳，以鉴定第一和第二链合成质量。在剩余的8μl第二链cDNA中依次加入：1μl 10×连接酶缓冲液，1μl 10mmol/L γ-三磷酸腺苷(γ-ATP)；1 μl T₄DNA连接酶(4U/μl)，8℃孵育过夜后，70℃孵育30min。冷却后依次加入：1μl 10×连接酶缓冲液，2μl 10 mmol/L γ-ATP；6μl蒸馏水，1 μl T₄多核苷酸激酶(10U/μl)，37℃孵育30min，70℃孵育30min。

Xho I酶切和分级分离：在前步反应混合液中加入28μl Xho I缓冲液和3μl Xho I内切酶(40U/μl)，37℃孵育1.5h。为了提高全长cDNA克隆在cDNA文库所占的比例，应用Sepharose CL-2B树脂填柱，进行过柱分级分离，以去除小于400～500bp的核苷酸。

将cDNA克隆入ZAP噬菌体表达载体：在1.5 ml离心管中依次加入：100ng cDNA，0.5μl 10×连接酶缓冲液，0.5μl 10mmol/L γ-ATP(pH7.5),1.0 μl ZAP噬菌体表达载体(1μg/μl)，加水至4.5μl，再加入0.5 μl T₄DNA连接酶(4U/μl)，12℃孵育过夜。

ZAP的包装：取1μl连接反应混合物加入已在冰上溶解的25μl包装蛋白溶液中，混匀，22℃包装2h。加入500μl的SM缓冲液和20μl的氯仿，混匀，此包装的噬菌体即为原始的cDNA文库。

库容量的测定：取5μl原始的cDNA文库，用45μl SM缓冲液稀释，取10μl稀释液加入200μl感受态XL1-Blue MRF'宿主菌(OD₆₀₀=0.5)，37℃保温20min。加入3 ml熔化(48℃)的NZY培养基上层琼脂，混匀后立即铺于LB平板上，凝固后倒置37℃培养过夜。计算平板上清晰的克隆数。

cDNA文库的扩增和保存：由于原始的cDNA文库不稳定，非野生型的噬菌体容易失活，因此，为保持cDNA文库一定的滴度，需对原始库进行一次扩增。根据原始库的库容量，将原始库分为若干份。每份含约5×10⁴个克隆。将每份分别加入600μl感受态XL1-Blue MRF'宿主菌(OD₆₀₀=0.5)中，37℃保温20min。加入6.5ml熔化(48℃)的NZY培养基上层琼脂，混匀后立即铺于150mm LB平板上，凝固37℃倒置培养6～8 h。然后每盘加入8ml的SM缓冲液，于4℃轻摇过夜后收集上清液，即得到扩增后的cDNA文库。加入0.3%氯仿和7%二甲基亚砜(DMSO)，在-70℃长期保存。

新全长cDNAs的克隆随机克隆的表达序列标签序列测定：cDNA文库铺盘(200～500个克隆/150mm盘)，挑取单个噬菌斑转入含有500μl SM缓冲液和20μl氯仿的灭菌离心管中。室温置2h后振摇，短暂离心后，取5μl上清液，应用插入片段两端的载体引物进行多聚酶链反应(PCR)。反应总体积为50μl，扩增参数为：94℃ 3min，再94℃ 5min，57℃ 30 s，72℃ 3min,共进行30个循环后，再72℃ 3min。每个PCR产物经琼脂糖凝胶鉴定质量后，取2μl的PCR 产物，用荧光素标记的cDNA 5'端载体引物进行测序PCR扩增反应。反应总体积为8μl，扩增参数为：94℃ 2min，94℃ 30s，50℃ 15s，72℃ 1min，进行20个循环，再94℃ 30s，72℃ 1min，15个循环，最后72℃ 5min。PCR反应结束，取6μ1 PCR产物，用自动测序仪(Pharmacia ALF DNA Sequencer)进行表达序列标签序列测定。

新全长cDNAs的克隆和测序：用美国生物信息学中心的BLAST软件，将每个cDNA克隆的表达序列标签与GenBank/EMBL/DDBJ数据库进行同源性比较分析^［1］。根据分析结果，将相应的ZAP噬菌体克隆环化为pBK-CMV质粒，扩增后应用QIAGEN公司(德国)的“QIAprep Spin Miniprep Kit”提取质粒DNA，在ABI377自动测序仪上进行序列测定。cDNA全长序列通过设计引物采用步移法获得。

2结果

2.1互补脱氧核糖核酸文库构建的效率

将包装好的重组ZAP噬菌体颗粒与一定比例的宿主菌XL1-Blue MRF'混合，铺板后计算白色菌落(带有插入片段的转化子)。结果，动脉和心脏cDNA文库的白菌率分别为98%和96%。

2.2互补脱氧核糖核酸文库的质量鉴定

据估计，人类基因mRNA的平均长度为2kb。为估计所建文库插入片断的大小，从动脉和心脏cDNA文库中各随机挑选96个克隆，用载体克隆位点两端引物进行PCR扩增，电泳分析。结果见附表。