【摘要】 目的 研究血小板第4因子(PF4)抑制血管新生的机制。方法 通过研究PF4与纤维母细胞生长因子－2(FGF2)及其受体间的相互作用来探讨PF4抑制血管新生的机制。结果 FGF2与低亲和力和高亲和力位点的结合受PF4抑制，这种抑制呈浓度依赖性。5～10μg/ml的PF4能最大限度地抑制FGF2与低亲和力或高亲和力位点(FGF受体)结合。0.72μg/ml的PF4能使FGF2与低亲和力位点结合减少50％，0.6μg/ml的PF4能使FGF2与高亲和力位点结合减少50％。2μg/ml的PF4能完全抑制内皮细胞的增殖。在该浓度下，PF4使125I－FGF2的内化下降近3倍。结论：PF4抑制血管新生的机制之一是抑制FGF2与其受体结合。

Study on the Mechanism of Platelet Factor 4 Inhibiting Angiogenesis

Han Zhongchao，Yang Renchi.

（Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, State Key Laboratory of Experimental Hematology, CAMS and PUMS, Tianjin 300020）

【Abstract】 Objective To explore the mechanism of platelet factor 4 (PF－4) inhibiting angiogenesis. Methods To investigate the mechanism by examining the interaction of PF－4 and the fibroblast growth factor－2(FGF－2)/fibroblast growth factor receptor (FGFR) system. Results FGF－2 binding to low－affinity sites or high－affinity binding sites was inhibited in a concentration－dependent manner by PF－4. Maximum inhibition of FGF－2 binding to low－affinity sites or high－affinity binding sites (FGF receptors) reached at 5～10μg/ml PF4 with half maximum inhibition at 0.72 and 0.6μg/ml, respectively, and proliferation was completely inhibited at 2μg/ml. At this concentration, PF－4 reduced internalization of 125I－FGF－2 by threefold and degradation delayed. Conclusion One mechanism of PF－4 inhibiting angiogenesis is that the binding of FGF－2 to its receptor is inhibited by PF－4.

【Key words】 Angiogenesis Platelet factor 4 Fibroblast growth factor 2

恶性肿瘤的侵袭与转移有赖于血管新生。血管新生受一系列刺激和抑制因子调节，这些因子控制着内皮细胞的增殖和迁移。其中主要的血管新生刺激因子有碱性纤维蛋白生长因子(FGF2)和血管内皮生长因子(VEGF)，主要的血管新生抑制因子有血管抑素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、血小板第4因子(PF－4)等^[1～3]。FGF2通过与特异性细胞表面受体和硫酸肝素聚糖蛋白(proteoglycans，HGSP)结合而发挥其生物学作用。HGSP通过稳定FGF2/FGF受体、保护FGF2不被降解、或促进FGF2的寡聚而促进FGF2与高亲和力受体结合^[2]。有关PF－4抗血管新生的作机理尚未完全阐明，本文拟通过研究PF－4与FGF2及其受体间的相互作用来探讨其作用机理。

材料与方法

细胞：

将小鼠肺微血管内皮细胞(LEII细胞，美国红十字会 Thomas Maciag 博士惠赠)37℃下置于5％CO2孵箱，培养基为DMEM(GIBCO，Life Technologies),含10％胎牛血清(GIBCO)、1g/L葡萄糖、1％的谷氨酸以及50IU/ml的青霉素/50μg/ml的链霉素。将缺乏硫酸肝素的中国仓鼠卵细胞(CHOm－FGFR－1细胞，745－flg; 以色列Weizmann研究所Avner Yayon博士惠赠)置于含10％胎牛血清(GIBCO)、1g/L葡萄糖、1％的非必需氨基酸的DMEM培养基中，37℃下置于5％CO2孵箱培养。这种细胞HGSP的表达量小于5％。125I－FGF2与低亲和力位点(用20mmol/L的HEPES和2mol/L的NaCl抽提，pH7.4)的结合小于总的特异性结合的3％(125I－FGF2与低亲和力和高亲和力位点的结合的总和)。

细胞增殖实验：

按Bikfalvi等^[4]的方法进行：将细胞(2×10⁴)接种于3.5CM²的培养瓶中，含10％胎牛血清、1％的谷氨酸和抗生素的DMEM，经过贴壁过夜，用无血清的DMEM和含1％胎牛血清的待测培养基将细胞洗1次。加入相应浓度的FGF2和PF4，在特定的时间用库尔特细胞自动计数仪计数细胞数。

FGF2的结合实验

用¹²⁵I－Na(Pierce,Rockford,IL)标记FGF2，¹²⁵I－FGF2的比活性为8～20×10⁴cpm/ng。FGF2与低亲和力和高亲和力位点的结合实验按Moscatelli^[5]的方法进行：将2.5×105细胞接种于含完全培养基的3.5CM²的培养瓶中，培养2d。然后将细胞用冰预冷的磷酸缓冲液洗2次，再与相应浓度的¹²⁵I－FGF2在DMEM中(此培养基含20mmol/L的HEPES,pH7.4，0.15％的gelatin)4℃下孵育2h，有或无1μg/ml未标记的配体(FGF2)。孵育结束时将细胞用冰预冷的磷酸缓冲液洗3次，用冰预冷的20mmol/L的HEPES(pH7.4)，2mol/L NaCl将细胞洗20s，共2次，使¹²⁵I－FGF2与细胞的低亲和力位点解离：用冰预冷20mmol/L的醋酸钠(pH4.0),2mol/L Nacl将细胞洗20s，共2次，使¹²⁵I－FGF2与细胞的高亲和力位点解离。用Kontron MR250 γ计数仪(Saint－Quentin－Yvelines,法国)对结合的¹²⁵I－FGF2定量。用¹²⁵I－FGF2及超过其含量100的未标记的配体与空白培养瓶孵育以测定非特异性结合。总结合量减去非特异性结合量即为特异性结合量。

FGF2的内化和降解

¹²⁵I－FGF2的内化实验按Roghani等^[6]的方法进行：LEII细胞与¹²⁵I－FGF2(10ng/ml)加或不加PF4(2μg/ml)，37℃下置于5％CO2孵箱培养。在指定的时间将细胞用冰预冷的PBS洗涤3次，细胞表面结合的物质用抽提的方法去除：用含2mol/L Nacl的20mmol/L的HEPES(pH7.4)将细胞洗20s，共2次；用含2mol/L Nacl的20mmol/L的醋酸钠(pH4.0)将细胞洗20s，共2次。内化的放射活性按以下方法测定：用抽提缓冲液溶解细胞(缓冲液由10％的甘油、2％SDS和含1.6mmol/L EDTA的125mmol/L的Tris－HCl(pH6.8)组成)，然后用γ计数仪测定。在其他实验中，用15％的SDS－PAGE凝胶电泳将细胞提取物分开，干燥，放射自显影或用Phosphorlmager分析。溶液部分则与三氯醋酸(终浓度为12％)在4℃下共培养过夜，沉淀后分析溶于三氯醋酸的部分和沉淀部分的放射活性。

结 果

PF4抑制FGF2诱导的内皮细胞增殖

将小鼠肺毛细血管内皮细胞(LEII细胞)与PF4和FGF2(10ng/ml)共培养，6d后，单独与FGF2培养的LEII细胞数增加了3倍；而与PF4(2μg/ml)和FGF2共培养的LEII细胞数与对照组细胞数相同(见图1)。这说明2μg/ml的PF4完全抑制了FGF2诱导的内皮细胞增殖。

图1 PF4对内皮细胞增殖的作用

PF4抑制FGF2与内皮细胞结合

将LEII细胞与¹²⁵I－FGF2(10ng/ml)和PF4(1－10000ng/ml)共培养，FGF2与低亲和力和高亲和力位点的结合受PF4抑制，这种抑制呈浓度依赖性(见图2，3)。

图2 PF4对¹²⁵I－FGF－2与内皮细胞(高亲和力位点)结合的影响

图3 PF4对¹²⁵I－FGF－2与内皮细胞(低亲和力位点)结合的影响

5～10μg/ml的PF4能最大限度地抑制FGF2与低亲和力或高亲和力位点(FGF受体)结合。0.72μg/ml的PF4能最大限度地抑制FGF2与低亲和力结合，0.6μg/ml的PF4能最大限度地抑制FGF2与高亲和力位点结合。人VEGF165、血小板衍生生长因子BB(PDGF BB)、表皮生长因子(EGF)不与FGF2竞争结合位点。为了解PF4对FGF2结合的抑制效应，在PF4存在的情况下做¹²⁵I－FGF2与细胞表面受体交联的实验。用SDS－PAGE和同位素自显影的方法检测交联物。在PF4存在的情况下，交联物的强度减低了3倍(为对照组的34％，图4)。

图4 PF4对125I－FGF－2与FGFR交联的影响

抑制FGF2的内化、降解和生物活性

在有或无PF4(2μg/ml)存在的情况下，将LEII细胞与¹²⁵I－FGF2(10ng/ml)在37℃下共培养24h，分析与膜结合及细胞的¹²⁵I－FGF2的量，如图5所示。

图5 PF4对¹²⁵I－FGF－2内化的影响

¹²⁵I－FGF2的长期内化被PF4抑制。无PF4时(■)，¹²⁵I－FGF2内化的最大值为0.209ng/106细胞，加PF4后(○)，内化值降为0.102ng/10⁶细胞。加