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Inhibition of Implanting Tumor Growth by Intubation of Powdered Shark Cartilage in Mice and Relationship to Microvascular Density
Cai Zhengrong， Qian Ruizhe, Jin Huiming, et al.
（Department of Pathophysiology, Shanghai Medical University (200032)
Davis, Yi He,
（Wellington School of Medicine, New Zealand.）
【Abstract】 Objective To Study the effect of shark cartilage powder on the growth of implanting SRS , its relationship to microvascular density and the expression of VEGF and FIk－1. Method Tumor slides were stained with vWF ：Ag antibody,VEGF antibody and FIk－1 antibody immunohistochemically(ABC) and then were studied by a computerized image processing system. Results The 54mg/day treatment group mice have lower tumor weight and smaller microvascular density compared to control(P＜0.05),and the depression of expression of VEGF and its receptor Flk－1 in the treatment group. Conclusion The growth of the mice implanting SRS lymphoma can be suppressed by intubation of shark cartilage powder of 54mg daily after 15d and the expression of VEGF and Flk－1 can be depressed by shark cartilage powder. The inhibition of tumor angiogenesis might be one of the mechanisms of the antitumor efftcts of shark cartilage powder and it relates to the depression of the expression of VEGF and Flk－1.
【Key words】 Shark cartilage powder Tumor angiogenesis Microvascular. VEGF FIK－1
口服鲨鱼软骨粉作为一种抗肿瘤的疗法正在临床试用。有人认为其作用机制可能与鲨鱼软骨粉中抗血管形成因子[1-4]有关。用含有鲨鱼软骨粉提取物的聚合物小碟移植于兔角膜可抑制肿瘤新血管网的形成[1,5]。对小鼠肿瘤部位注射鲨鱼软骨粉混悬液可减少肿瘤新生血管的形成[6]，并且现已从鲨鱼软骨粉中提取出抗血管形成因子[7]。因此口服鲨鱼软骨粉的抗肿瘤新生血管形成的作用正在进一步研究中。
本实验将观察口服鲨鱼软骨粉对小鼠移植性实体肿瘤(SRS)生长的影响及其与微血管密度的关系。
材料与方法
鲨鱼软骨粉：由新西兰惠灵顿医学院内科研究所提供(来源于Waitaki Biosciences, Christchurch, New Zealand)。
小鼠肿瘤模型：采用6周龄昆明种健康小白鼠126只，随机分为实验组与对照组。本实验采用SRS(Shanghai Reticular Sarcoma)腹水瘤细胞株[8]。该细胞株是于1965年建成L6565病毒性白血病株，并于1971年用6565白血病小鼠的胸腺细胞悬液，接种到昆明种小鼠腹腔，建立了SRS淋巴细胞腹水瘤。用SRS腹水瘤传代小鼠的腹水0.2ml(含肿瘤细胞9.6×103个/m3)，于小鼠左前肢根部腋窝皮下注射。接种肿瘤后第2d开始对实验组小鼠用18号针头经口喂饲各种浓度的鲨鱼软骨粉混悬液(分别为36mg/ml，54mg/ml，72mg/ml，108mg/ml)0.5ml，对照组以同容量的生理盐水代替，1日2次。每5d称重并记录体重。实验第15d处死小鼠并切开皮肤，取出肿瘤，使用精度至0.01g的天平(shangping FA1004)称量肿块重量、摄影，并留取标本，液氮冷冻或置于10％福尔马林中固定保存。
将肿瘤标本切片作HE染色及兔抗人Ⅷ因子(vWF)相关抗原抗体(ABC法、DAB显色)染色以显示血管内皮细胞。染色方法如下：肿瘤组织石蜡切片常规二甲苯及系列酒精脱蜡；PBS洗5min；0.3％H2O2处理切片10min，以消除内源性过氧化物酶作用；PBS洗5min3次；0.1mg/ml胰蛋白酶(Trypsin)室温下孵育切片10min；PBS洗5min3次；10％绵羊血清封闭切片(室温下孵育切片10min)，吸去封闭剂，勿洗；加1：100稀释兔抗人Ⅷ因子相关抗原抗体(Dako公司，华美公司分装)，1:200稀释兔抗小鼠VEGF、FIK－1抗体(博士德公司),37℃恒温湿盒内孵育60min，或4℃冰箱内孵育16～72h；PBS洗5min3次；加入1：100稀释二抗(Biotin－anti－Rabbit抗体，华美公司)，37℃恒温湿盒内孵育30min。试剂A、B 1：50稀释后等体积混合，37℃孵育30min，即成ABC；切片PBS洗5min3次；切片上加入ABC试剂，37℃恒温湿盒孵育30min；PBS洗5min3次；DAB稀释并加入3％H2O2至终浓度为0.03％H2O2，加入切片显色5～30min，显微镜下控制显色。冲洗切片，系列酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阳性对照采用体外培养血管内皮细胞涂片，阴性对照用PBS代替一抗。
光学显微镜下作形态观察。通过称重，比较实验组及对照组体重的动态变化及实验结束时两组肿瘤重量的差别，计算肿瘤切片中单位面积里微血管数(MVD)。方法如下[9]：所有切片均采用Ⅷ因子相关抗原抗体免疫组化染色以显示血管内皮细胞。在100×低倍镜下观察棕染的微血管及小静脉密集区。肿瘤的新生血管(DAB染色棕染)密集区多位于肿瘤与正常组织的交界处，计数时应以血管密集区为准，避免硬化和坏死区。肿瘤组织内散在的单个微血管作为测定灰度值的内参照。计数血管在200×(20×物镜，10×目镜，0.74m/视野)光镜下进行。切片中任何可与周围组织明确区分的棕染内皮细胞及细胞群均作为一个血管计数。血管可无管腔，红细胞不作为血管标志。每张切片计数选用五个视野和血管计数的平均值。所有切片均由两个观察者按统一标准计数。每张切片计数时间均在5～10分钟以上。步骤：1.在切片上四个角及中央用记号笔作好五点标记，使标记尽量分布于正常蓝染的肿瘤组织区域，避开红染的无组织区和裂缝。2.在10×10倍低倍镜下观察，选取计数视野。计数视野的选择，统一选取标记点的左上角。3.在20×20高倍镜下观察并计数微血管。4.将五个计数视野的计数求平均数，将两组数据进行统计学处理。并采用Leica Q500IW图象处理分析系统处理vWF:Ag抗体免疫组化染色切片，采用141nm波长，测试面积为0.7m，在每张切片上选取5个血管密度最大的区(免疫组化棕染的微血管达5个以上[9])，测定其灰度值，并求其平均值(表示单位面积内的染色物质的吸光强度)、标准差，将两组数据进行统计学处理。
光学显微镜下观察兔抗小鼠VEGF抗体染色切片，用低倍镜(100×)观察全片染色情况，并确定是否有深棕染的细胞。评价标准为：(1)以肿瘤及其附近的血管内皮细胞浆出现黄色的为阳性表达，按其染色深浅分级评分，不染色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，深棕黄色为3分。(2)按视野中染色阳性细胞的比例评分。无阳性细胞为0分，阳性细胞＜25％为1分，阳性细胞26％～50％为2分，阳性细胞＞50％为3分。(1)(2)项相加最大值为6。两项相加大于3者为切片VEGF抗体染色呈阳性。兔抗小鼠Flk－1抗体染色切片处理同vWF:Ag抗体免疫组化染色切片。应用Leica Q500IW图像处理分析系统处理，采用141nm波长，测试面积为0.7mm2，在每张切片上选取深染细胞密度最大的区(微血管密集区)，测定其灰度值，并求其平均值(表示单位面积内的染色物质的吸光强度)、标准差，将两组数据进行统计学处理。
统计学处理：本文实验的计量资料用平均值±标准差表示， 自身比较和组间比较均用t检验， 或χ2检验。
结 果
1 荷瘤小鼠体重动态变化：在实验的第1d、第5d、第10d、第15d时称量小鼠体重，比较小鼠体重发现各实验组中治疗组及对照组、各性别、各时间点差别均无显著意义，P＞0.05。
2 不同剂量鲨鱼软骨粉治疗小鼠15d后收获的部分肿瘤大小：观察比较发现，54mg/d剂量治疗组肿瘤体积明显较对照组小(图1，见插4)。
3 肿瘤重量的变化：根据小鼠灌饲的鲨鱼软骨粉的剂量分组，54mg/d治疗组治疗15d后收获的移植性肿瘤重量明显低于对照组，与其余各组相比较也有明显差异(P＜0.05，见图2)。
4 54mg/d剂量治疗组与对照组肿瘤组织中微血管密度： SRS组织切片微血管染色显示， 54mg/d剂量组治疗(图3，见插4)小鼠肿瘤组织中微血管密度明显低于对照组(图4，见插4)。照片中深染处为血管内皮。
图1鲨鱼软骨粉54mg/d剂量治疗SRS菏瘤小鼠15d肿瘤大小比较
图2.鲨鱼软骨粉剂量与肿瘤重量效应关系(＊P＜0.05)
