基础研究的进展
红细胞聚集的发生机制和影响因素很复杂。血液中的红细胞聚集离不开血浆中一些特定大分子的参与,如纤维蛋白原等。离体的红细胞在一定浓度的某些外源性高分子溶液中(如Dextran70,polylysine,heparin等)也会发生相似的聚集现象。流速降低、聚集大分子浓度升高均可导致解聚力减小,使聚集更容易发生。许多病理状态下都有红细胞聚集性升高的现象,原因多在于此。
本世纪二十年代初,由于注意到许多病理状态都伴随严重的红细胞聚集,Fahraeus首先提出了红细胞聚集性具有重要的临床意义。近年来一系列体外检测结果更清楚地表明:一些疾病如心肌缺血、脑缺血、雷诺氏综合征、糖尿病、动脉硬化、高脂血症、高血压等,血浆纤维蛋白原或球蛋白水平异常增高,都同时伴随红细胞聚集指数升高的现象。另外血浆粘度、Hct(血细胞压积)、红细胞变形性的改变也会在红细胞聚集性上有所反应。研究发现:手术、麻醉、创伤休克后红细胞聚集性提高;烧伤休克后血容量降低,红细胞聚集显著;孕期妇女的红细胞聚集性很高,分娩后则降为正常;相比之下,胎儿、新生儿红细胞聚集性比成人低很多。随着年龄的增长,聚集性逐渐升高。此外,运动与长期锻炼可以改善红细胞功能,使聚集性降低[1]。
六十年代出现了旋转粘度仪,工程技术上实现了对低速流动粘度的精密测量,红细胞聚集的研究从此得以广泛开展。学者们对聚集的发生机制和影响因素做了大量工作,同时红细胞聚集性成为一项独立的检测指标开始用于临床。到了七十年代后期,光探测技术、超声技术、核磁共振技术等进一步丰富了研究手段,用于专门测量聚集性的多种聚集仪相继出现,使红细胞聚集的临床检测更加便捷、准确。发展至今,测量仪器不断改进更新,细胞功能、血液性状的综合检测与多参数输出成为技术发展的趋势。红细胞聚集性指标在医学预防、监测、诊断、治疗过程中越来越发挥重要作用。
一定Hct的血液可以在足够的时间内形成大小一定的、稳定的聚集体。稳定聚集体的结构信息称为聚集程度;形成稳定聚集的快慢称为聚集速度;施加外力(如剪切流场)使聚集体刚好开始发生解聚,一般用此外力来代表聚集力。三者都是红细胞聚集特性的表示。具体来讲,目前采用的测量指数(AggregationIndex或AI)大致有如下几种[2]:
1流变学参数:低速流的血液粘度、粘弹性以及血沉(ESR)等。
2静态参数:反映聚集体的形状、大小以及形成聚集体的相邻细胞的间距等。
3动力学参数:表征红细胞聚集形成和解聚速度的参量。
针对不同的参数,相应有不同的测量方法,下面将一一介绍。
测量方法
红细胞聚集是造成血沉的主要原因。血液中的红细胞相互碰撞形成聚集之后,在重力的作用下快速沉降。研究一致认为,ESR(红细胞沉降率)与红细胞聚集密切相关[3]。用红细胞聚集体形成之后测得的最大沉降速度表示聚集程度。ESR测量一般采用Westergren方法,有快速、简便的优点。然而影响ESR的因素除了聚集以外还有许多,作用均难以忽略,因此必须至少同时测量全血压积Hct和血浆粘度来较正ESR。可以看出,ESR只能间接地反映红细胞聚集,而且血液沉降中聚集形成时细胞所受流体剪切力作用在不断变化,难以控制和测定,所以用它来深入研究聚集现象有很大的局限性[2]。
血液以低切速流动,其粘度会随着聚集的形成而逐渐升高。借助各种旋转式粘度仪,可以测得某一特定切速下细胞悬浮液的粘度值来反映聚集程度。同血沉法类似,它也是一种间接参数,Hct、变形性和血浆粘度也都是影响因素,必须对黏度值加以修正。这个方法的优点在于粘度仪的使用很方便,切速也可以精确控制。很早有人采用Weissenberg流变仪测量不同切速下的粘度η和ηo,然后计算一个相对粘度比值R做为聚集指数:
R=(η/ηo)Dextran/(η/ηo)Saline其中,分子项是红细胞在Dextran中的相对粘度,分母项是在不引起聚集生理盐水中的相对粘度。
血沉法和粘度法是早期研究红细胞聚集时采用的方法。由于红细胞聚集性只是影响血沉和血粘度的因素之一,其它因素如血浆粘度,对低切速下全血粘度的影响也十分显著,病理状况下更是如此。为了揭示聚集性单方面的重要作用,需要对聚集速度、聚集程度、聚集力的大小作直接观测和定量。实验室研究在这方面做了大量工作。
1新的流变参数:
更确切地说,血液是具有粘弹性的非牛顿流体,表观粘度η实际上由粘性分量η’与弹性分量η”构成。η’来源于血液在流动中的能量耗散,与Hct、血浆粘度、以及血液组分在流动中的变形、取向都有关系;η”来源于聚集体的弹性性质,它与红细胞膜以及聚集大分子的性质有关。用血液的弹性性质可以反映细胞的聚集能力。有人采用振荡式毛细管流变仪,将不同剪切力下的血液粘弹性作聚集指数来定量细胞聚集[4]。
2波散射技术(光学法):
研究发现,光束通过细胞悬浮液,其透射光强与聚集程度有关,可以直接反映聚集体的平均大小,实现对聚集进行动态测量,得到直接反映聚集程度的动力学参数。Myrenne聚集仪根据这个原理制成。它主要是一台透明锥板粘度计。加入少量血样,在高切速下使聚集体充分分散后停止剪切,记录10秒内透射光强的变化,计算光强对时间的积分值为聚集指数。此方法测得的结果与血沉法、粘度法结果相关性很好。但是当病理状态下血样聚集情况严重时,即使很高切速也难于将聚集体完全打散,10秒内的透光强度变化不大,这样带来的测量误差就很大。改进的Myrenne聚集仪采用多参数测量。不仅记录了静态聚集的透光曲线,得到光强-时间积分、光强曲线幅值,还对改变切速的聚集、解聚过程作测试分析,得到动态聚集、解聚形成的一系列特征时间和解聚发生的最小剪切速度等参数。结果表明:单一参数有时不能反映聚集特性,多参数可以一定程度地避免这种片面性。
进一步研究发现,光通量受血层厚度以及红细胞对光的吸收系数影响非常大,于是He-Ne激光取代了普通光源,在其工作谱范围内红细胞对光的吸收很少,从而减少了能量耗散,提高了测量的准确性。散射光强随聚集发生而动态地变化,从衍射图样上还可以得到聚集体的结构、形态信息,都是很好的聚集指数[5]。
超声技术是另一个新的手段。超声波是一种周期应力波。低功率的超声波可通过介质探测粒子的大小,用它可以精确测得悬浮液聚集体的结构信息。声波穿透血层,收集散射后回波的声强信号转化成数字信号,计算得到一系列静态与动态参数,用来表征聚集特性[6]。超声波穿透能力强,对于无损伤测量体内聚集的研究有良好的前景。
波散射技术测量时假定粒子在溶液中均匀分布,因而波的强度信号与Hct密切相关。光学方法所能测量的Hct上限为5%,超声技术为13%~20%,Hct过高则会由于严重的波散射效应而使结构与强度信号的线性相关性受到影响。所以对研究接近生理浓度(45%)的红细胞聚集性来说,这个方法就无能为力了。另外,粒子的大小、折射系数和介质的折射系数都对强度值有影响,存在不可避免的系统误差。但此方法血样用量少,使用方便,已发展研制成了多种专用的聚集仪,广泛用于临床与研究。
3显微观测的结构参数:
随着显微录像技术、计算机图像处理技术的发展和成熟,用显微观测的方法来对聚集直接定量成为可能。利用高倍物镜,可将细胞聚集体放大千倍以上。经镜下观察、实时录像和计算机图像处理,可得到红细胞聚集体的多种结构参数。作者曾对静态红细胞聚集的形成过程做过详细观测。聚集体的平均长度、直径、分支形态等都是能够直接反映聚集的指数。Stoltz等人在对红细胞聚集体作了大量图像分析之后,提取聚集体的二维投影面积S和周长P,表示成聚集指数AI为[2]: aI=4πS/P2。
一般用平行板结构的小室与显微录像相配合进行观测,小室结构简单,大多根据需要自行设计。薄层红细胞悬浮液均匀流过视野,流速由低速灌流泵控制,细胞相互碰撞形成聚集;或者预先注入细胞悬浮液令细胞沉降,在底部完成聚集之后加以剪切力使聚集体在流动中解聚,全过程直观可见。录像结果经计算机处理,可提取二维聚集体形态的有关参数作为聚集指数,例如聚集体所占的二维投影面积与全部细胞所占的投影面积之比,平均每个聚集体内所含细胞的个数等。瞬时改变流速又可得到依时间变化的聚集动态信息[7,8]。Chien等人则研究流动小室中的聚集体在施加剪切力时发生相对位移的情况,记下使相邻两个红细胞产生50%细胞直径的相对位移的切速度,作为聚集指数表征红细胞的聚集力[9]。
除平行板透明小室外,也有人用显微观测方法研<
