【摘要】目的应用我所新建立的循环内皮细胞（CirculatingEndothelialCells，CEC）的分离计数方法计数急性心肌梗塞患者外周血中循环内皮细胞含量的改变并检测其凋亡。方法Percoll密度梯度离心后，将其先后标记以鼠抗人CD31抗体，FITC-羊抗鼠IgG及碘化丙啶。应用流式细胞仪计数CD31阳性细胞的百分比，并通过检测CEC的DNA倍体含量检测其凋亡状态。结果急性心肌梗塞组（n= 16）与正常对照组（n= 16）的CEC分别为62.9±24.5/ml及29.9±9.1/ml全血，两者有非常显著性差异（P＜0.0001）。两组均为双倍体DNA，无亚二倍体峰的出现，说明无细胞凋亡的发生。结论此方法克服了以往CEC研究方法的缺点，提高了特异性及回收率，使CEC真正成为来自活体的特异的且直接反映血管损伤的量化指示物。

Changes in the Level of Circulationg Endothelial Cells in Acute Myocardial Infarction Patients and the Detection of Its Appotosis

Chi Xuan，Li Hongwei，Xiao Linsheng，et al．

Institute of Microcirculation，Peking Union Medical College ＆ Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100005

【Abstract】 Objective The aim of this study is to count CEC in peripheral blood of acute myocardial infarction （AMI） patients and to detect its apoptotic state，using FACS analysis．Methods The peripheral blood was Percoll density gradient centrifuged and analyzed with flow cytometry，using CD31 monoclonal antibody and propidium iodide．Results CEC counting is 62.9±24.5／ml and 29.9±9.1／ml whole blood in AMI patients （n= 16） and age-matched controls （n= 16） respectively （P＜0.0001）．There were no signs of apoptosis in both groups．Conclusion There was significant increase in CEC level in AMI patients，indicating that endothelial injury in AMI patients occurred significantly．Our result proved that FACS analysis is efficient in counting and identifying the functional status of CEC in various cardiovascular diseases．

【Key words】 Acute myocardial infarction Circulationg endothelial cells Apoptosis

内皮细胞衰老或受损后自基底膜脱落，循环于外周血中，称循环内皮细胞（CirculatingEndothelialCell，CEC）^［1］。我们对不同生理病理条件下唯一来源于活体成年血液中的内皮细胞的功能、代谢、生长率等进行研究，因而避免了长期以来体外实验的局限性。自Takahashi于1983年用VonWillebrand因子（vWF-Ag）鉴明“内皮样细胞”确为内皮细胞后^［2］，即引起心血管研究领域学者们的关注，并在多种病理情况下于患者的外周血中检测到CEC的存在^［3～4］。自1983年以来的15年间，CEC的研究方法经不断改进，由光镜下单纯依赖形态学鉴别，进展到目前最常用的Percoll密度梯度离心后以因子VⅢ-R： Ag作为内皮细胞标记物鉴别计数^［5］。此方法的缺点是血小板与内皮细胞密度重叠，不易清楚分开，而且血小板与巨核细胞对因子VⅢ-R： Ag的荧光抗体也呈阳性反应，而有些血管内皮细胞对因子VⅢ-R： Ag的荧光抗体染色却呈阴性反应，所以此方法的特异性及回收率均受限制。

我们建立了一种新的循环内皮细胞的分离技术方法，即Percoll密度梯度离心分离出目的细胞层后，将其先后标记以鼠抗人CD31抗体及FITC-羊抗鼠IgG，应用流式细胞仪计数阳性细胞的百分比，以表达血液内循环内皮细胞的数值。此方法克服了以往方法的缺点，提高了特异性及回收率，且取血量少，仅需3ml外周血，使CEC真正成为来自活体的特异的且直接反映血管损伤的指示物。应用此方法我们计数了急性心肌梗塞患者外周血中循环内皮细胞含量的改变并检测其凋亡。

材料与方法

试剂3.8％枸橼酸钠（北京，中国）；Percoll储存液，密度1.130±0.005g/ml（Sigma，美国）；2％台盼蓝（北京，中国）；小鼠抗人CD31单克隆抗体（Coulter，美国）；FITC-羊抗小鼠IgG（Coulter，美国）；小鼠IgG1（阴性对照）（Coulter，美国）；牛血清白蛋白（天津血液研究所，中国）；RNaseA（Sigma，美国）；碘化丙啶（Sigma，美国）。

仪器真空硅化试管（Costar，美国）；流式细胞仪检测管（Coulter，美国）；流式细胞仪（Coulter，美国）；离心机（RennerGmbh，德国）；微量称量天平（SartoriusResearch，瑞典）。

实验方法

1血样采集： 肘正中静脉采血3ml，加入预装有3.8％枸橼酸钠（w／v）0.33ml的硅化试管中。最初采集的2ml血弃去，以避免静脉穿刺时脱落的内皮细胞参入。

2Percoll密度梯度离心法分离^［6～7］： 配制密度分别为1.060g/ml及1.045g/ml的Percoll分层液。100ml 1.060g/ml的Percoll分层液由42.9ml Percoll储存液，10ml集成人血清，37.1ml DMEN及10ml 3.8％枸橼酸钠配成。100ml 1.045g/ml的Percoll分层液由30.3ml Percoll储存液，10ml集成人血清，49.7ml DMEM及10ml 3.8％枸橼酸钠配成。将两种密度的Percoll分层液各3ml轻辅于离心管内。用Hanks液将上述抗凝血稀释1倍，摇匀，清铺于分层液表面，以水平离心机离心，1800rpm×20分钟；离心后目的细胞层悬于两层分层液面之间，呈白膜状，用毛细吸管将目的层细胞吸出，移入另一试管；大量Hanks液清洗离心两次，1500rpm×10分钟；以0.5％台盼蓝检查细胞活力，活细胞比例要求在95％以上。

3抗体标记： 在收获的细胞悬液内加小鼠抗人单克隆抗体CD31 20μl，用PBS-2％BSA 1∶50稀释，室温孵育60分钟。之后用PBS-0.5％BSA清洗、离心两遍，1500rpm×10分钟，弃上清液，将沉淀制成细胞悬液，加FITC-羊抗小鼠IgG 20μl（PBS-2％ BSA 1∶50稀释），避光室温孵育30分钟；PBS-0.5％BSA清洗、离心两遍；阴性对照以小鼠IgG1代替一抗。

4细胞固定： 加0.5mlPBS，将细胞打散，用注射器吸取细胞缓慢注入到5ml 70％冷乙醇中固定一天或更长的时间。

5RNaseA配制： 用1.12％枸橼酸钠平pH8.2配制RNaseA5000μg/ml，加温至75℃孵育30分钟以使DNase灭活，再用1.12％枸橼酸钠做1∶10的稀释，终浓度为500μg/ml，分装于1ml安瓿中冻存，每次使用前复溶。

6碘化丙啶染色^［8～9］： PBS洗两次细胞，加1mlPBS于细胞悬液内，加RNaseA至终浓度为50μg/ml，置37℃水浴中消化30分钟，取出立即放入冰浴中，再加DNA染料碘化丙啶至终浓度为5μg/ml，放入冰中于4℃冰箱暗染1小时，用200目尼龙网过滤除去杂质及细胞团块。

7流式细胞仪检测：（1） CEC计数及鉴定^［10］： 在装备有488nm光线氩离子激光光源的Cοulter EPICS PROFILE II Flow Cytometer上检测。根据前向角光散射的不同，每例标本收集10000个细胞，根据阴性对照设定门，以检测CD31阳性细胞的百分比；（2） CEC DNA倍体检测^［11］： 收集CD31阳性细胞门内的细胞，使用488nm光线氩离子激光光源。检测其DNA倍体含量。应用EPICS ELLTE Flow Cytometer Workstation program version 3.0，分析凋亡细胞的比例。凋亡细胞被定义为亚二倍体细胞，其DNA含量应至少为二倍体细胞的5％，小于5％的部分被认为是碎片。

8统计学方法及制图： 应用Graphpad Instat Verson 1.14统计软件分别计算均数及标准差，CEC绝对值以均数±标准差表示。进行组间t检验，P＜0.05认为差别有显著性意义。应用MicroCalOrigin 3.0软件制图。

本实验中我们首先应用Percoll密度梯度离心法分离细胞，其密度为1.045～1.060g/ml，循环内皮细胞即包含于此层中，除此以外还包括部分单核细胞及血小板。随后应用流式细胞仪检测CEC。识别内皮细胞的标志是小鼠抗人单克隆抗CD31，血小板内皮细胞粘附因子（PECAM-1）。CD31是细胞外粘附分子，属于免疫球蛋白基因超家族，是130Kda的整合性膜糖蛋白，由6个Ig样C₂同源亚单位组成。已证明CD31在所有类型的内皮细胞表面结构性，均一性地表达^{［12～13］}。

经流式细胞仪计数时，首先根据前向角光散射收集细胞，前向角光散射的强度与细胞大小有关，由于血小板直径小于内皮细胞，其前向角光散射较小，因此在散点图中与细胞碎片一起位于内皮细胞群的下方，易于分开（图1）。由于去除了血小板的影响，因此提高了此方法的特异性。在散点图中设定门，收集细胞10000个。再在荧光直方图中分析收集细胞中CD31阳性细胞的百分比（图2）。

图1散点图

在本图中首先根据前向光散射角（forwardlightscatter）将包含CEC的目的细胞群与血小板及细胞碎片分开，所选定区域内的细胞即为目的细胞群