导言

在动脉血栓性疾病的病理过程中，血小板活化是重要的始动因素。有许多物质，如凝血酶、肾上腺素等可导致血小板的活化和聚集。近年来研究发现，血流中单纯的高剪切应力也可以诱导血小板聚集。这不但对于存在高剪切应力的血管，如小动脉，动脉痉挛和动脉硬化造成的局部狭窄区的血栓形成有特别重要的意义，还可在其下游形成微血栓，堵塞微血管，造成微循环障碍。因此，研究剪切诱导血小板聚集（Shear induced platelet aggregation，SIPA）的机理有十分重要的意义。

早在1845年由德国病理学家RudolphVirchow提出血液流动在血栓形成中的作用。他认为，在生理条件下，血液流动、血管因素和血液成分是维持正常凝血、止血功能的三个基本要素。这三个要素中任何一个要素的改变都可导致血栓形成或止血功能障碍。

血小板在血液循环中沿着血管壁附近的流层流动，不粘附于正常的血管内皮表面。在血管中，靠近管壁的血液流速最低，而在血管轴心部位流速最高。因此，从轴心到管壁形成了不同流层的速度梯度，就是由于这种速度梯度的存在产生了对血小板两个侧面不同的作用力，形成了剪切作用。许多研究的结果支持剪切应力可以直接活化血小板。Moake研究指出：在给予180dynes／cm²的病理性剪切应力0.5和5.0min后，如果有大的vonWillebrand因子（vWF）多聚体存在，就出现血小板聚集，而这种聚集不需要其他外源性激活剂。血小板膜糖蛋白Ib／IX（GpIb／IX）和IIb／IIIa（GpIIb／IIIa）的单克隆抗体可以抑制这种聚集。缺乏纤维蛋白原时，则没有多大影响。研究进一步发现，该过程中可观测到血小板内的［Ca^2＋］升高到原来的10倍以上，EGTA与细胞外Ca^2＋的鳌合完全抑制剪切应力引起的［Ca^2＋］升高与血小板聚集；阻断血小板释放ADP也可抑制SIPA^［1］。

这些结果表明剪切诱导的血小板聚集至少有以下因素参与：（1）血小板膜糖蛋白Ib／ΙX 和IIb／IIIa，（2）血浆vWF，（3）一定浓度的血浆Ca^2＋和ADP。用分子生物学手段研究则对剪切诱导血小板聚集的认识大大深入了。

剪切诱导血小板聚集的分子机制研究

GpIb／IX复合物是血小板膜上最主要的糖蛋白之一。它是由 GpIb和GpIX（17KD）这两个跨膜糖蛋白以1∶1比例通过非共价方式组成的异二聚体复合物，其中GpIb是由两个亚单位GpIbα（145KD）和GpIbβ（24KD）以二硫键连接而成^［2］。GpIb／IX的主要功能是识别血管壁中的vWF，使血小板粘附到血管内皮下^［3］。对GpIb／IX功能的认识来自于对遗传性巨大血小板综合征（Bernard-souliersyndrome，BSS）患者的临床研究。这种病人临床上呈出血倾向。这种变化可由于GpIbα、GpIbβ、GpIX或GpV中任何一种的缺失或改变^［4］。GpIb／IX与vWF的结合位点，位于GpIbα氨基端的45KD片段中，与GpIbα相当的合成肽丝氨酸₂₅₁-酪氨酸₂₇₉和甘氨酸 ₂₇₁-甘氨酸₂₈₅可抑制血小板与vWF结合^［5］。

GpIIb／IIIa复合物是血小板膜上最丰富的受体，它也存在于血小板表面管道膜和α-颗粒中。当血小板激活时，这些细胞内受体池也能在血小板表面表达。GpIIb/IIa是由GpIIb（136KD）和GpIIIa（92KD）两个亚单位，在钙离子参与下，以1∶1比例通过非共价方式组成的异二聚体复合物^［5］。它的主要功能是与纤维蛋白原结合，通过纤维蛋白原的“桥”的作用把血小板与血小板、血小板与内皮下结构等连接起来形成血小板栓。它还可以与其他含有Arg-Gly-Asp（RGD）片段的粘附蛋白如vWF、纤维连接蛋白、外连接蛋白等结合，参与血小板的粘附与聚集。RGD序列与GpII／IIIa的结合位点在GpIIIa的109-171残基的63个氨基酸的一段序列中。与GpIIb／IIIa结合的另一序列是Lys-Gln-Ala-Asp-Val序列，它只存在于纤维蛋白原中^［6］。血小板无力症（Glanzmann’sthrombasthenia）患者血小板缺乏GpIIb／IIIa，临床上呈出血倾向。

vWF在内皮细胞或巨核细胞中合成，在内质网中通过二硫键结合成二聚体，这是vWF的基本构型，还可在高尔基体中形成多聚体。内皮细胞分泌的vWF可进入血液循环，也可进入腔外，从而成为内皮下基质的一部分，在调节血小板粘附到血管壁过程中起重要作用。巨核细胞中的vWF，被包装进入血小板的α-颗粒，当血小板激活时再分泌。在vWF上与GpIb／IX的连接区在Val₄₄₉-Lys₇₂₈这么一个52／48KD的片段上。vWF与GpIIb／IIIa的连接区在第1744-1747位氨基酸上，是一个Arg-Gly-Asp-Ser四肽。 vWF通过中介血小板粘附到暴露的血管内皮和促进血小板血栓在血管损伤部位的形成而参与止血过程，特别是有高剪切应力存在的情况下，血小板通过vWF单层覆盖在损伤的内皮下层。在这里vWF作为一个连接“桥”的功能，一端是内皮下成分，如胶原；另一端是血小板GpIb／IX。vWF与GpIb／IX的相互作用引起血小板的活化， 并随着其他激活剂的参与，促进其他血小板补充到生长的血栓上，在这一点上，vWF与GpIIb／IIIa的连接是最重要的。vWF的基因长达150-200KD，任何基因改变影响vWF的合成与表达都可导致vWF质或量的异常，即血管性假血友病（vonWillebranddisease，vWD），临床上表现为出血倾向，实验室则表现为血液低凝或不凝^［7］。

目前的研究资料表明，剪切应力是作用于血小板，而不是作用于血浆中的vWF，使血小板的受体对vWF呈短暂的活化状态。这些对剪切敏感的血小板膜成分大概是GpIb／IX的一部分^［8］。人们假设在剪切应力作用下，vWF与GpIb／IX的初始作用成为血小板聚集中血小板“簇”的起始点，并且这个血小板“簇”可以成为一个集中多种血小板活化物质的微环境，包括ADP和肾上腺素等，从而进一步扩大剪切引起的刺激^［9］。剪切诱导的初始的触发过程非常难以捉摸，就目前的技术难以研究它微妙的过程。

建立在剪切诱导vWF与GpIb／IX连接基础上的研究资料，支持GpIb／IX与vWF连接后，可发生信号，使血小板外Ca^2＋转移进入细胞内。另外，抑制vWF与GpIb／IX的连接则可以完全抑制［Ca^2＋］的升高和聚集反应，而抑制vWF与GpIIb／IIIa 的连接只能部分抑制这两种变化。由此可见，vWF与GpIb／IX的连接对血小板内［Ca^2＋］的升高和聚集是绝对必要的^［1］。vWF与GpIb／IX 连接可开放Ca^2＋通道的机理尚不明了。但这种细胞内［Ca^2＋］升高不是简单一个受体被占领的结果，也许还包括以下影响：多聚的vWF分子包括重复的GpIb／IX连接区，它与同一血小板和／或邻近血小板上的几个GpIb／IX相互连接。研究发现代表vWF上单个GpIb／IX连接的重组片段对剪切诱导的影响是一个有效的抑制剂，但它单独对细胞内［Ca^2＋］不能产生多大影响，从而支持血小板单个受体占领不能有效地产生Ca^2＋的跨膜内流^［10］。

有研究者提出血小板 GpIIb／IIIa 也许就是 Ca^2＋通道或邻近 Ca^2＋通道。当用单克隆抗体或合成的RGDS肽抑制配体与GpIIb／IIIa的连接，可引起凝血酶刺激的血小板膜非电压依赖性的Ca^2＋ 减少。其他资料也显示抑制血小板GpIIb／IIIa上vWF的连接点可抑制（而不是完全消除）细胞内［Ca^2＋］对剪切应力的反应^［1］。也有研究者认为这种作用 更象一种间接的影响，如同在实际中看到的，先天性GpIIb／IIIa缺乏的病人血小板中，剪切诱导的［Ca^2＋］变化仍正常发生，但不会聚集。支持［Ca^2＋］变化不是GpIIb／IIIa作用的结果，从而认为这可能依赖于抗体识别的抗原决定簇的定位，在许多情况下，由于空间排列的障碍而使邻近的离子通道的功能受到影响^［10］。

通过磷酸肌酸／磷酸肌酸激酶来改变剪切应力下血小板释放ADP的试验，证明ADP对SIPA也是需要的，但它对细胞内［Ca^2＋］升高没有影响。由此可见剪切应力引起的［Ca^2＋］升高不是释放的ADP活化血小板的反馈的结果，从而支持剪切应力诱导的 vWF-GpIb相互作用引起的细胞内［Ca^2＋］升高，早于ADP的释放^［1］。由血小板释放的ADP，参与了SIPA，但它不是诱导血小板聚集的主要因素。这一过程中它的具体作用尚不清楚。

特异性的第二信使如何把 GpIIb／IIIa变成活化的vWF的受体也不清楚。但是这个信息网可能包括Ca^2＋、蛋白激酶C（PKC）、丝氨酸-苏氨酸激酶、酪氨酸激酶和磷脂酰肌醇-3-激酶^［11］。已知剪切诱导的血小板聚集与血小板—白细胞C激酶底物（pleckstrin）的磷酸化有关，而这种磷酸化完全依赖vWF与血小板受体的连接。血小板-白细胞C激酶底物是PKC的底物，抑制PKC可有效地抑制血小板与vWF相互作用^{［12，13］}。表明当剪切诱导vWF与GpIb／IX连接时，可通过一个使PKC活化的途径使血小板聚集。病理性剪切水平下，血小板酪氨酸激酶也可被活化，但它功能上的重要性仍未确定^［14］。

目前已知激活GpIIb／IIIa需细胞外Ca^2＋的参与，同时至少通过两条途径：一是被G蛋白依赖的肌醇磷脂水解始动，引起PKC激活和［Ca^2＋］升高；另一条是仅在高浓度凝血酶存在或胶原存在时，不依赖肌醇磷脂的途径^［5］。

剪切诱导血小板聚集过程中钙离子的作用

Ca^2＋