【摘要】目的在大鼠主动脉球囊损伤模型上，研究血管中三种一氧化氮合酶异构体(神经型，内皮型和诱导型)在内膜增殖过程中表达的变化。方法20只Wistar大鼠分成5组，损伤组(n=16)：行胸腹主动脉球囊拉伤，术后1、3、7、14天取材；对照组(n=4)：不进行球囊损伤。应用蛋白印迹杂交的方法，观察主动脉损伤后内膜增殖过程中神经型，内皮型和诱导型一氧化氮合酶表达的变化。结果在正常血管中，存在着神经型和内皮型一氧化氮合酶的表达；血管损伤后1天，诱导型一氧化氮合酶出现表达，3天达高峰，较术后1天增加48%，并持续到术后14天。内皮型一氧化氮合酶在损伤后1、3、7、14天，表达较对照组分别增加50%，105%，86%，49%。神经型一氧化氮合酶在内膜增殖过程中无动态改变。结论血管损伤后，正常血管内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶表达的上调，对抑制血管内膜增殖起一定的代偿作用；诱导型一氧化氮合酶表达的增加，在抑制内膜增殖方面起主要作用；神经型一氧化氮合酶与内膜增殖可能无关。

Changes of nitric oxide synthase in itimal hyperplasia

following rat aortic balloon injury

Peng Xu，Wang Lihui，Yin Hang

（Department of Cardiology, the First Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100034）

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of three isoforms of Nitric oxide synthase (nNOS, eNOS and iNOS) in rats following aorta balloon injury. MethodsEndothelial denudation of aorta in Wistar rats was performed with Forgarty 2F balloon catheter. At the 1st, 3rd, 7th, 14th day following balloon injury, the rats were killed and aortas were taken out. The expression of NOS was assayed by Western blot. ResultsIn normal conditions, vasa express the nNOS and eNOS. Expression of iNOS was detected at the 1st day following balloon injury, peak at the 3rd, and lasted till the 14th day. eNOS expression was increased by 50%, 105%, 86% and 49% at 1st, 3rd, 7th and 14th respectively, compared with the control group. No changes were detected about the expression of nNOS following vascular injury. ConclusionThe increased expression of eNOS and iNOS may play a role in the inhibition of neointimal hyperplasia following vascular injury. There is no relationship between nNOS and neointimal hyperplasia.

【Key words】Nitric oxide synthaseIntimal hyperplasiaSignal transduction

血管成形术后6个月内30%～60%的再狭窄高并发率严重影响了经皮冠状动脉血管成形术的临床疗效^［1］。一氧化氮可抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移，抑制细胞外基质的沉积^［2］；使用L-精氨酸或体内转染一氧化氮合酶可抑制球囊损伤后血管内膜的增殖^［3，4］，因此NO在血管受损后再狭窄的发生中可能起重要作用。因为NO的半衰期仅2～6 s中，弥散的距离也很短，所以NO作用的发挥，与一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的分布与表达密切相关。到目前为止，已克隆了三种由不同基因编码的NOS，根据它们存在部位和正常生理情况下表达的差异，可分为神经型NOS(neuronal NOS,nNOS),内皮型NOS(endothelial NOS,eNOS)和诱导型NOS(inducible NOS,iNOS)^［5］。它们在血管内皮剥脱后再狭窄形成的过程中的作用，目前尚不十分清楚。本实验拟在大鼠主动脉球囊拉伤模型上，应用蛋白印迹杂交的方法，研究体内三种一氧化氮合酶表达的动态变化，以探讨其在再狭窄发生中的作用。

材料与方法

1.材料：一氧化氮合酶抗体(nNOS,eNOS和iNOS)购自Santa Cruz公司，化学发光试剂盒购自NEW^TM Life Science公司，Wistar大鼠由北京医科大学实验动物中心提供。

2.主动脉血管损伤模型制备^［6］：20只体重300～350 g Wistar大鼠分成5组，采用0.5%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔麻醉后，对颈部皮肤进行碘酒、酒精消毒，在颈正中切开皮肤3 cm,依次分离皮下组织与肌肉，在左胸锁乳突肌内侧，寻找颈总动脉；将颈总动脉与迷走神经分离后，远心端结扎，近心端用动脉铗夹闭，于颈总动脉远端用眼科剪剪一小口，插入自制的2 F球囊导管至腹主动脉远端，注入0.1 ml生理盐水使球囊扩张至直径与血管直径之比为3.5∶1,然后回拉球囊至左颈动脉与胸主动脉交叉处，回抽生理盐水后重新插回导管，在三个相隔120度的方向重复三次共9次，最后拔出导管，结扎动脉；逐层缝合皮下组织与皮肤，术后局部使用青霉素以预防感染，喂食普通饲料，自由引水。对照组大鼠仅进行颈部手术，不进行血管损伤。

3.蛋白印迹杂交^［7］：在主动脉球囊拉伤后1、3、7、14天,将大鼠处死，取胸腹主动脉，剥离血管外附着的结缔组织，剪碎，加入1 ml改良的RIPA裂解缓冲液(Tris HCl,50 mmol/L pH 7.5；NaCl 150 mmol/L;NP 40,1%;脱氧胆酸钠，0.5%；SDS,0.1%；EDTA 1 mmol/L；PMSF 1 mmol/L；Leupeptin 2 μg/ml),冰浴条件下进行组织匀浆；4℃,10!000 g离心10 min,弃除沉淀，采用考马斯亮蓝方法对上清进行蛋白定量，取20 μg蛋白，加入上样缓冲液，煮沸3 min后进行SDS-PAGE,转膜，用1∶1!000的抗一氧化氮合酶多克隆抗体进行杂交，二抗采用1∶10!000稀释，利用化学发光法进行显色反应。

4.HE染色：在球囊损伤后1,3,7,14 d,用4%多聚甲醛对血管进行原位固定，取胸主动脉的中间段约3 cm,在4%多聚甲醛中继续固定2 h,30%蔗糖固定48 h后，OCT包埋，液氮冻存，连续冰冻切片8 μm,分别进行HE染色。

结果

1.血管腔与内膜面积的变化：HE染色显示正常对照大鼠胸主动脉内皮完整，呈单层裱衬在血管腔表面；球囊损伤1 d,可见内皮细胞剥脱，7 d时血管内膜增殖，2周后内膜增厚更明显。

2.iNOS的动态改变：对照组的正常血管未见iNOS的表达，损伤后1天，血管中出现iNOS的表达，术后3天表达进一步增加，较1天时增加48%；术后7天和14天，仍可检测到iNOS的表达，但较3天时降低23%和39%(见图1)。

图1大鼠主动脉球囊损伤后不同时间iNOS的动态改变(n=2)

3.eNOS的动态改变：正常血管中可见eNOS的表达，血管受损后1天，eNOS的表达较对照增加50%,3 d,7 d,14 d时分别增高105%,86%,49%(见图2)。

图2大鼠主动脉球囊损伤后不同时间eNOS的动态改变

4.nNOS的变化：球囊损伤后1、3、7、14 d,nNOS的表达较对照组无明显变化(见图3)。

图3大鼠主动脉球囊损伤后不同时间nNOS的变化

讨论

一氧化氮合酶能催化L-精氨酸合成一氧化氮，在维持正常血管张力，抑制血小板聚集方面有重要作用，理论上，当血管内皮细胞剥脱后，因为NO合成的减少，血管将失去调节正常张力，抑制血小板聚集的作用。但研究发现，在血管内皮剥脱后，血管很快恢复了抗血小板聚集，调节血管张力的功能，产生这种现象的原因，可能与血管损伤后，NOS表达代偿性增加有关^［8］。本研究发现，在正常血管中，仅有eNOS和nNOS的表达，iNOS不表达。在血管受损后1天，iNOS开始表达，损伤后三天，表达达高峰，并可持续到血管受损后2周。eNOS的变化与iNOS相似。nNOS在血管损伤后，无动态改变。

Hansson等^［5］研究发现，正常情况下，血液中不能检测到NO，当血管受损后，血液中的NO含量升高，引起NO合成增加的原因与血管新生内膜中平滑肌细胞iNOS表达的上调有关，而与eNOS的活性无关，表明iNOS在内皮受损后NO合成方面起重要作用。引起血管受损后iNOS表达增加的原因尚不清楚，在早期可能和细胞因子或其它分子通过NFκB,激活iNOS的启动子有关。iNOS在血管受损后7到14天的高表达则可能和血管局部白细胞介素-1,干扰素-γ和肿瘤坏死因子的刺激有关^［5］。

正常血管中eNOS主要存在于血管内皮细胞中，它的活性主要受钙调素的调节，另外，血管切应力的变化对NO的生成也具有影响。本研究的发现和文献报导不同。Banning等^［9］在猪颈动脉球囊损伤模型上，采用RT-PCR的方法，发现在球囊损伤后一天，eNOS的mRNA表达减低，至术后7天，恢复至正常水平。产生这种差异的原因，一方面可能是由于动物种属和血管类型的差异造成的，另一个重要的原因，可能是因为本模型是造成的从胸至腹整条主动脉的内皮损伤，存在着内皮剥脱不全的现象，加上血流切应力的影响，诱使未剥脱内皮eNOS在损伤后一天即表达增加。

nNOS主<