［摘要］为了研究极低密度脂蛋白受体结构与功能的关系，本文利用反转录聚合酶链反应技术从中国人心肌组织中克隆出极低密度脂蛋白受体的全长cDNA后，将其插入真核表达载体pcDNA3获得重组体pCD-VR。测序结果发现，这一源于中国人的极低密度脂蛋白受体基因cDNA的碱基序列与文献报道基本相符。反转录聚合酶链反应检测证实，转染 pCD-VR的中国仓鼠卵巢细胞可有效表达极低密度脂蛋白受体mRNA。脂蛋白结合实验结果发现，转染的中国仓鼠卵巢细胞结合极低密度脂蛋白的能力明显增高。

［中图分类号］Q78［文献标识码］A

［文章编号］1007-3949(2000)-03-0189-04

The Cloning and Expression on Chinese Hamster Ovary Cells of Chinese Very Low Density Lipoprotein Receptor Gene

QU Shen，WANG Jian-Bo，LIU Zhi-Guo，DENG Yao-Zu，FENG Zong-Chen

(Department of Biochemistry, Tongji Medical University, Wuhan 430030, China)

ABSTRACTAimTo study the relationship of very low density lipoprotein receptor (VLDLR) structure and its function.MethodsThe present paper reported the cloning of VLDLR gene cDNA from a chinese heart tissue by RT-PCR technology.A recombinant named pCD-VR was constructed in which the VLDLR cDNA was inserted a vector pcDNA3. ResultsSequencing result confirmed that the chinese oriented VLDLR gene cDNA was in line with previously one. Then, the pCD-VR was transfected into CHO cells. Lipoprotein combination test and mRNA detection confirmed that this human VLDLR gene could express effectively in the CHO cells.ConclusionIt was provided a new idea about the roles of VLDLR in atherosclerosis.

MeSHLipoprotein, LDL；Genes；CHO Cells；Atherosclerosis

极低密度脂蛋白受体（very low density lipoprotein receptor, VLDLR）属低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor,LDLR）家族^［1］，由846个氨基酸组成，其蛋白质结构与LDLR非常相似，不同之处在于LDLR的配体结合域有7个重复序列，而VLDLR有8个重复序列，相应地其基因结构比LDLR多一个外显子。在功能上，LDLR主要与含有载脂蛋白B100和载脂蛋白E的脂蛋白结合；而VLDLR主要与富含载脂蛋白E的脂蛋白结合。LDLR活性受胆固醇下调，而VLDLR活性不受胆固醇下调。由此看来，VLDLR与LDLR在功能和调控方面的差异与受体结合域的结构差异存在必然联系。本文进行了中国人VLDLR基因的克隆、序列分析及在中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary, CHO)细胞中表达的检测，探讨VLDLR结合域中8个重复序列在执行结合脂蛋白功能中的作用及中国人较易罹患高甘油三酯血症的机理。

1材料与方法

1.1组织与细胞

心肌组织从施行心脏手术患者近心耳处采集。CHO-K₁细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。

1.2试剂与仪器

DiI(Molecular probes,USA),F12培养基与胎牛血清(Gibco,USA),Lipofectin(Gibco,USA)， Expend^TM长模板DNA聚合酶(BOEHRINGER MANNHEIM公司)，PCR引物由GIBCO BRL公司合成。SuperScript^TM Preamplification System购自GIBCO BRL公司，限制性核酸内切酶及T₄DNA 连接酶购自Bio-Lab公司，Sephadex G-25购自Phamacia。

1.3总RNA提取

取少量心肌组织匀浆，用异硫氰酸胍一步法^［2］提取细胞总RNA，再通过紫外分光测定含量及纯度，甲醛凝胶变性电泳检测其完整性。

1.4反转录反应

按SuperScript^TM Preamplification System操作指南进行。取总RNA5 μg，Oligo（dT）12～18 1 μL，补DEPC处理水至12 μL，混匀，70℃ 10 min后冰上冷却，加入反应混合液（10×buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl₂ 2 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，0.1mmol/L DTT 2 μL)混匀，42℃预热5min，加入1 μL反转录酶，42℃反应50min,70℃灭活反转录酶15min，-20℃保存。

1.5扩增反应

根据Yamamoto等报道的人VLDLR cDNA序列设计了一对引物（P1、P2）。在P1 5’末端设计了一Bam HI酶切位点，P2 5’末端设计了一Xba I酶切位点。P1（sense) 5'-GGGATCCCCATCCAGGCGGGCAC

CATG-3’(-24～3)， P2（antisense）(2 862～2 890) 5'-CGGATCCGGCCAGAGGTGGCAATACTGTC-3’，P3 5'-ACTGGGACAGGAACAGGTAT-3' (2 194～2 214)。 PCR反应总体积为50 μL：引物各20 μmol，dNTPs各10 mmol，Mg²⁺ 75 mmol，Expend^TM长模板DNA聚合酶2.5 u, cDNA模板2 μL。反应条件为：94℃ 4 min，然后94℃ 45 s，55℃ 45 s，68℃ 3 min，循环5次，更换循环条件为94℃ 45 s，62℃ 5 s，68℃ 3 min，循环35次，最后68℃延伸10 min。

1.6重组体的构建和鉴定

将扩增的cDNA片段经琼脂糖凝胶电泳后采用透析袋挡板法回收，经酚、氯仿抽提，无水乙醇沉淀^［3］。 载体pcDNA3与RT-PCR扩增的目的基因片段均用Xba I和Bam HI进行酶切，电泳回收纯化后，按摩尔比1∶3连接（总DNA 200ng，1 μL 10×T₄DNA连接酶缓冲液，1单位T₄DNA连接酶，加水至10 μL， 15℃反应16 h）。取连接液转化感受态细菌后，在LB固体培养皿上取氨苄抗性菌落培养扩增，用碱变性法制备重组质粒。重组质粒经Bam HI、Nhe I、Hind Ⅲ、Apa I酶切电泳鉴定。重组质粒经氯化铯离心^［4］纯化后测序。

1.7细胞培养与基因转移

CHO-K₁细胞用含10%胎牛血清的F12在37℃、5%CO₂的条件下培养。基因转染用Lipofectin介导的方法进行。转染后48 h检测外源基因的表达。基因转染的CHO细胞用含G418（800mg/L）的F12持续筛选至稳定表达VLDLR的CHO细胞。

1.8极低密度脂蛋白受体表达

以反转录产物为模板，以P1、P3为引物，利用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，同时进行β-actin基因扩增作为内参。循环条件为：94℃变性4min，94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 3 min，循环35次，最后72℃延伸10 min。

1.9脂蛋白分离

取正常人空腹血400 mL，加入EDTA-Na₂抗凝，8 000 r/min 离心15 min，分离血浆。加入PMSF 1 μmol/L、NaN₃ 1 mmol/L及谷胱甘肽，12 000 r/min离心30 min，除去顶层乳糜微粒。加入NaCl将血浆密度调至1.1 kg/L，55 000 r/min 10℃离心5 h后，吸取上层VLDL及LDL混合物。在35.5 mL Beckman离心管中，由上到下依此加入1.006 kg/L、1.063 kg/L梯度液及VLDL和LDL混合物，55 000 r/min离心3 h，分离VLDL及LDL^［5］。

1.10脂蛋白的DiI标记

分离的VLDL用PBS透析12 h,取出后用无菌的PBS将蛋白浓度稀释至1g/L。同样用无菌的PBS调节去脂血清至其蛋白浓度为4 g/L。调好后的脂蛋白溶液与去脂血清溶液按1∶4体积比混合后，加DiI储液,比例为150 μg DiI∶1 mg脂蛋白，混匀,过滤除菌(0.45 μm)，37℃避光孵育8～12 h。用NaCl 调密度至1.1 kg/L,超离（条件为：4℃～10℃，50000r/min,2.5 h）后，吸取上层VLDL，经PBS透析8～12 h，用0.45μm滤膜过滤除菌。测定溶液荧光强度和蛋白浓度，计算标记率。

1.11脂蛋白结合实验

瞬时表达pCD-VR的CHO细胞与DiI标记的VLDL结合实验于转染后8～72 h进行。结合实验前48 h加25-羟胆固醇和胆固醇于细胞培养基中（终浓度分别为1 mg/L和10 mg/L）,以抑制LDL受体表达。 结合开始时，弃细胞培养液，用PBS加入冰中预冷的含DiI标记脂蛋白的结合反应液，4℃孵育3 h，用含0.2%牛血清白蛋白的冰冷的PBS洗三次，以去除未结合的DiI标记的脂蛋白。然后每皿（35 mm）加入1 mL细胞裂解液（1 g/L SDS、0.1 mol/L NaOH），混匀，此细胞裂解液可同时用于荧光强度和蛋白浓度的测定，结果以DiI标记脂蛋白/细胞蛋白(mg/g)，即DiI-VLDL/Cell protein（mg/g）表示。

2结 果

2.1总RNA的鉴定

总RNA经紫外分光光度计定量，OD₂₆₀/OD₂₈₀＞1.9。RNA经甲醛变性凝胶电泳后，在紫外观测仪下可见清晰的28S、18S、5.8S三条带，表明RNA纯度和完整性较好，可用于反转录反应。

2.2反转录聚合酶链反应

从pCD-VR转染的CHO细胞中分离总RNA后，经RT-PCR反应获得的产物经琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下观察到一清晰条带，与期望的VLDLR cDNA长度（2.9kb）相符（图1,Figure 1）。

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