［摘要］为探讨人白细胞介素17冠心病在发生发展中的作用。我们应用逆转录多聚酶链反应技术，利用自行设计合成的引物，从植物血凝素活化的正常人外周血单个核细胞中，扩增出人白细胞介素17基因，成功构建了人白细胞介素17基因重组体，经测序确认为人白细胞介素17基因，同时利用随机引物标记基因探针，经核酸杂交显示冠心病患者人白细胞介素17 mRNA表达明显增加，其相应血清标本中可溶性细胞间粘附分子-1含量亦增高。说明人白细胞介素17在冠心病发病机制中起着重要作用，并为进一步研究人白细胞介素17的生物功能提供可靠的物质基础。

［中图分类号］R541.4［文献标识码］A

［文章编号］1007-3949(2000)-03-0256-04

Cloning and Probe Preparation of Human Interleukin-17 Gene and It's Application for Patients with Coronary Disease

CAO Kai-Yuan，FENG Lian-Qiang

(Department of Immunology, Kidney Institute of the First Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)

ABSTRACTAimTo explore human interleukin-17 （hIL-17）gene in the pathogenesis of coronary disease.MethodsReverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to amplified hIL-17 gene from activated peripheral blood mononuclear cells (PBMC), hIL-17 gene was confirmed by DNA sequencing.Expression of hIL-17 mRNA in PBMC was determined by dot hybridization techniques.Serum levels of soluble intercellular adhesion molecule-1 (sICAM-1) was determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method.ResultsWith reference to the published sequence of the human IL-17 gene, a pair of DNA primer were designed and synthesized.A 473 bp fragment encoding fall length of hIL-17 cDNA gene was successfully amplified by using RT-PCR, and then cloned into pUC18 vector.The recombinant plasmid was sequenced to confirm hIL-17gene.Meanwhile, Using random-prime synthesis of probe for hIL-17 gene.We apply for dot hybridization techniques to determine the over expression of hIL-17 mRNA in peripheral blood monocytes (PBMC) with coronary disease, and their high levels of sICAM-1.ConclusionshIL-17 gene may play an important role in the pathogenesis of coronary Disease.Our experiment also lay a profound foundation for further analysis of hIL-17 biological functions.

MeSHInterleukin-17;DNA Probes;Nucleic Acid Hybridization;Cloning, Molecular;Coronary Disease

人白细胞介素17（human interleukin-17, hIL-17）是新近发现的细胞因子^［1］，它由激活的CD4-T淋巴细胞分泌，目前研究表明它可参与T淋巴细胞与造血系统的相互作用，其主要生物学功能是可以刺激多种其他细胞因子的产生，如IL-6、IL-8、G-CSF和PGE2。并使细胞表面的细胞间粘附分子-1 （ICAM-1）的表达增加^［2～4］。动脉粥样硬化的发生﹑发展与细胞粘附分子和细胞因子有着密切相关的关系^［5～7］。为此，我们利用分子生物学技术初步探讨hIL-17在冠心病发病中的作用。

1材料与方法

1.1研究对象

正常对照组共21例，男12例，女9例，年龄40～63 （55.3±8.8）岁，为体检合格、经临床及实验室检查排除心脏疾患的健康者。急性心肌梗死组共15例，男9例，女6例，年龄42～69 （51.2±4.9）岁，临床症状、心电图及血清酶学改变符合1979年WHO诊断标准。冠状动脉狭窄组共9例，男6例，女3例，年龄41～62（54.4±3.6）岁，均经冠状动脉造影显示狭窄≥50%。各组受试对象均排除高血压、糖尿病、脑血管病、周围血管病、感染性疾病、免疫性疾病等。

1.2外周血单个核白细胞mRNA的提取

淋巴细胞梯度分离液分离单个核细胞，正常成人PBMC 以Hank's液洗3遍以1×10⁹/L 的浓度在含终浓度30 mg/L 植物血凝素的RPMI 1640完全培养基中于37℃，5%CO₂中培养48 h，收集细胞，以磁性分离系统（PolyATract1000， Promega）分离mRNA，冠心病患者无需植物血凝素刺激，直接分离mRNA，以作反转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）及斑点杂交备用。

1.3人白细胞介素17基因的扩增

根据文献［1］自行设计引物并由中国科学院上海细胞生物学研究所合成，上游引物为5'-GGGAATTCGATGACTCCTGGGAAGACC-3'；下游引物为5'-GAAAGCTTAGGCCACATGGTGGA

CA-3'。参照Promega产品说明书合成cDNA第1 条链。常规聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增hIL-17 互补脱氧核糖核酸（complementary DNA, cDNA）基因。

1.4质粒构建

分别将PCR产物和pUC18载体用EcoRI 和 HindIII 双酶切，在低融点琼脂糖（LMA）上回收，T4 DNA 连接酶(Promega)连接，转化大肠杆菌DH5a，构建重组质粒pChIL-17。

1.5质粒酶切鉴定及序列测定

以碱法小量快速制备质粒DNA，用EcoRI/HindⅢ、PvuⅡ、BglI 和TaqI 酶切质粒，进行初步鉴定。用PE公司310型基因分析仪对所得质粒进行DNA序列分析。

1.6探针制备及斑点杂交

1.6.1白细胞介素17基因探针制备以Digoxigenin-11-dUTP作为标记物，随机引物法标记hIL-17 cDNA探针。标记程序参照宝灵曼公司DIG-High Prime试剂盒操作手册进行。

1.6.2斑点杂交先用蒸馏水浸湿，然后浸于10×SSC中，10 min，装于斑点杂交96孔点样。将已提取的标本核酸和阴阳性对照进行加热变性，100℃ 10 min，立即放入冰水中，通过96孔点样器吸印到硝酸纤维膜上，室温下凉干后， 80℃干烤2 h。将膜放入杂交袋中，加入杂交液10 mL，（5×SSC，0.1% Sarcosine，0.02% SDS， 1%封阻剂），排除气泡封口，68℃水浴，预杂交2 h。倒净预交中的溶液，加2.5 mL新杂交溶液，再加经煮沸变性好的Dig - hIL-17基因探针100 μL混匀， 68℃水浴杂交6 h。室温下，以洗膜液Ⅰ（2×SSC， 0.1% SDS ）100 mL，5 min，洗膜2次。在68℃条件下用洗膜液Ⅱ （0.1×SSC，0.1% SDS）100 mL，15 min，洗膜2次。显色观察结果。

1.7血清可溶性细胞间粘附分子-1的测定

采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清可溶性细胞间粘附分子-1，药盒购自美国P&D system。

1.8统计学方法

采用t检验和χ²检验。

2结果

2.1反转录聚合酶链反应扩增人白细胞介素17 cDNA基因

以PHA活化的正常人外周血单个核细胞mRNA为模板，通过RT-PCR 扩增得到的产物，经琼脂糖电泳，在480 bp左右有1条明显的带，与理论设计相符（图1, Fig 1），而未活化的正常人外周血单个核细胞对照中，末见有特异性扩增片段。

2.2人白细胞介素17基因克隆的建立及初步鉴定

克隆所得重组质粒DNA，用EcoRI和HindⅢ 双酶切鉴定，可见在480 bp左右有1 条带，与PCR产物相符。同时以PvuⅡ、BglI和TaqI作酶切，结果各酶切图谱与理论上的pChIL-17序列的电脑分析图谱完全一致（图1, Fig 1）。故初步证实这一克隆为hIL-17 cDNA克隆。

图1反转录聚合酶链反应扩增人白细胞介素17基因及其重组质粒的酶切鉴定

Fig 1Amplification of hIL-17 gene by RT-PCR and identification of recombinant plasmidA. RT-PCR amplificate activated PBMC. B. pUChIL-17/EcoRI/HindⅢ digests (2635, 473 bp). C. pUChIL-17/Taq I digests (1444, 1206, 458 bp).D. pUChIL-17/PvuⅡ digests (2364, 744 bp). E. pUChIL-17/Bg1 I digests (1658, 1118, 332 bp).F. Marker Spp I.G. RT-PCR amplificate activated PBMC

2.3序列测定

为了进一步确定所得的克隆，我们利用正负链进行双向DNA序列测定，结果表明在pUC18中插入的基因为hIL-17 cDNA基因。所得到的碱基与国外报道的hIL-17 cDNA基因序列完全一致。

2.4外周血单个核细胞的白细胞介素17 mRNA的斑点杂交

斑点杂交结果如图2 （Figure 2）所示。冠心病组PBMC人白细胞介素17 mRNA杂交阳性率为62.5% （15/24），对照组为14.3% （3/21），两者相比有显著差异性(χ² =10.848,P=0.001＜0.01)，提示hIL-17mRNA表达在冠心病组明显升高。说明h